石艷麗,李 巍,韓彩霞,張子群,李曉云,宋銘忻
(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,哈爾濱 150030;2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,北京 100193;3.黑龍江出入境檢驗檢疫局,哈爾濱 150036)
多拉菌素(Doramectin,DRM)是20世紀90年代美國輝瑞公司研制開發(fā)的新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物,DRM是一種阿維菌素的衍生物,經(jīng)過生物突變合成,在阿維菌素的C25上引入一環(huán)己烷而成,是一種最新的動物體內(nèi)外廣譜抗寄生蟲藥[1-3]。DRM為高親脂類物質,在動物體內(nèi)具有分布廣、組織排除緩慢、生物半衰期長等特點,因而生物利用率高[4-5]。其藥代動力學特性受給藥途徑、藥物劑型、動物種類和個體差異的顯著影響[6]。
本研究成功研制了多拉菌素澆潑劑,并經(jīng)臨床試驗證明具有高效、廣譜、安全及使用方便等特點。為了進一步研究多拉菌素澆潑劑的作用特點,為臨床用藥提供理論依據(jù),本文采用C18柱進行樣品前處理與純化,HPLC測定樣品中多拉菌素的含量,對多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)的藥物代謝動力學進行研究。
多拉菌素原料藥(浙江海正藥業(yè)有限公司提供,批號040801),純度:87.3%;多拉菌素標準品(Sigma公司,批號33993),純度:84.6%;N-甲基咪唑,99%;三氟醋酸酐,化學純(批號F20050926,國藥集團化學試劑有限公司);乙腈及甲醇,色譜純(德國默克公司);肝素(批號F20071010,上海山溏化工有限公司)。
健康綿羊6只,體重(30±0.48)kg,雌雄各半,試驗前飼養(yǎng)觀察一周,給藥前12 h起禁食,自由飲水,采樣期間正常飼養(yǎng)。
安捷倫高效液相色譜系統(tǒng);低溫高速離心機(德國Beckman);旋轉蒸發(fā)器,Laborota 4003型(德國Heidolph公司);真空抽氣泵,2XZ型(中國臨海市精工真空設備廠);固相萃取柱:ODSC18柱(100 g·L-1)(中國科學院大連化學物理研究所);色譜柱:Kromasil KR100C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇(100%);流速:1.0 mL·min-1;進樣量:20 μL;激發(fā)波長:365 nm;發(fā)射波長:475 nm;柱溫:30℃。
1.4.1 標準溶液的配制
精密稱取DRM的標準品25 mg,置于100 mL容量瓶中,用甲醇(色譜級)溶解并稀釋定容,搖勻,得標準儲備液(250 μg·mL-1),置于4℃冰箱保存,使用時根據(jù)試驗需要用甲醇(色譜級)配制到所需濃度。
1.4.2 衍生化試劑的配制
A液:N-甲基咪唑∶無水乙腈(1∶1,V/V)
B液:三氟乙酸酐∶無水乙腈(1∶2,V/V)
按照治療劑量0.5 mg·kg-1·bw-1多拉菌素澆潑劑涂擦于綿羊的兩耳及背部,并分別于給藥前及給藥后的2、4、6、8、12、24 h及2、3、4、5、6、7、9、11、14、17、20、24、28、35 d于綿羊頸靜脈采集血樣,10 mL·次-1,肝素抗凝并迅速置冰水中保存,3 000 r·min-1離心10 min,分離血漿并轉入另一離心管中,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
取0.5 mL血漿樣品添加DRM標準工作液,渦旋震動1 min。加入5 mL乙腈,渦旋震動混勻2 min,3 500 r·min-1離心5 min,取上清,重復兩次,合并上清液。置于旋轉蒸發(fā)儀中,減壓蒸干,加入0.5 mL乙腈,渦旋震動混勻,加入9.5 mL水,充分混勻,用C18固相萃取柱進行純化。固相萃取程序:C18柱先用5 mL乙腈進行洗脫,再用5 mL蒸餾水進行淋洗,將樣品過C18柱,依次用1 mL甲醇,10 mL乙酸乙酯進行洗脫并收集洗脫液,用氮氣在60℃沙浴中吹干,殘留物用100 μL N-甲基咪唑-乙腈溶液溶解,加入150 μL三氟乙酸酐-乙腈溶液混勻,靜置15~30 min,再加入750 μL無水甲醇終止反應,待上機測定。
取血漿樣品0.5 mL,加入多拉菌素標準品溶液,使血漿中多拉菌素的濃度(C)分別為0.1、0.5、1、5、10、15、25、50、75、100 ng·mL-1,參照1.6法制樣,進行HPLC檢測,記錄色譜圖,得峰面積(A),每個樣品重復測定5次,以A對C進行線性回歸,得回歸方程,根據(jù)血漿和組織標準曲線的相關系數(shù)估計樣品中多拉菌素定量的線性范圍。按信噪比≥3來確定DRM在血漿中的最低檢測濃度。
分別配制含多拉菌素高、中、低(40、20、5 ng·mL-1)3種濃度的血漿樣品各3份,參照1.6方法操作,分別于同日內(nèi)及連續(xù)不同日測定,計算其日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)及該提取方法的回收率。
血藥濃度-時間數(shù)據(jù)運用Marquardt法迭代擬合,通過對模型擬合的評價,根據(jù)AIC最小原則選出最佳模型,計算藥代動力學參數(shù),數(shù)據(jù)處理選用中國藥理學會編制的3P97程序運行,統(tǒng)計值以平均數(shù)±標準差表示(X±S)。
在上述色譜條件下,DRM標準品、空白血漿、空白血漿添加藥物色譜圖見圖1~3。由圖譜可見,本試驗所選用的分析條件可以較好地分離DRM,色譜圖基線平穩(wěn),雜質少,DRM與雜質分離良好,色譜峰對稱性好,DRMB1a和B1b分離良好,保留時間適中(B1a為9.5 min),表明DRM的HPLC檢測條件是比較理想的,從圖中可以看出,DRM在測定條件下與血漿成分分離良好。
圖1 多拉菌素標準品的HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatograms of standard preparation of doramectin
圖2 空白血漿色譜Fig.2 HPLC chromatograms of blank plasma sample
圖3 含多拉菌素血漿色譜Fig.3 HPLC chromatograms of plasma containing doramectin
多拉菌素在1~100 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好。以A(峰面積)對C(血藥濃度)進行線性回歸,得回歸方程為y=0.287x+0.431,R2=0.9985。最低檢測濃度為0.1 ng·mL-1。
結果見表1。
表1 綿羊血漿中多拉菌素的回收率及變異系數(shù)Table 1 Recovery rate and Variation coefficient of doramectin in sheep plasma
由表1可知,多拉菌素的回收率介于98.4%~101.5%之間,日間和日內(nèi)變異系數(shù)均小于10%,表明本試驗方法回收率高,準確度高,符合藥代動力學要求。
給藥后不同時間點的綿羊血漿經(jīng)過樣品處理并進行HPLC測定。給藥后35 d綿羊血漿中的DRM濃度均低于檢測線,藥時曲線見圖4。
圖4 綿羊血漿樣品中時間—多拉菌素平均濃度散點圖Fig.4 Graphic of mean doramectin concentrations distributed at distinct time points in sheep plasma
綿羊皮膚澆注多拉菌素澆潑劑后的主要藥代動力學參數(shù)。將試驗所得的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)經(jīng)3P97程序計算可知,綿羊皮膚澆注多拉菌素澆潑劑后在體內(nèi)的過程符合二室模型,有關藥代動力學參數(shù)見表1。
表2 多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)Table 2 Pharmacokinetics parameter of doramectin pour-on in sheep (n=6)
本試驗單劑量(0.5 mg·kg-1BW)給綿羊背部澆注0.5%多拉菌素澆潑劑后,血漿中藥物濃度的消除半衰期(T1/2Kβ)為4.95 d,根據(jù)半衰期判斷,多拉菌素屬于慢性消除藥物,這與張萍等在犬上的動力學研究(按照0.3 mg·kg-1BW皮下注射給藥,消除半衰期為4.78 d)[7]及張繼瑜等在豬上的藥動學研究(按照0.3 mg·kg-1BW靜脈注射,消除半衰期為6.11 d)[10]結果較接近。本試驗中多拉菌素在綿羊體內(nèi)的分布半衰期(T1/2kα)為1.89 d,較多拉菌素在犬皮下注射給藥時分布半衰期0.58 d及在豬靜脈注射給藥時分布半衰期1.09 d要大,說明0.5%多拉菌素澆潑給藥在綿羊體內(nèi)的分布相對其對犬皮下注射及豬靜脈注射的分布較慢,這主要與動物的種屬差異和不同的給藥途徑有關。
藥時曲線下面積(AUC)反映進入體循環(huán)藥量的多少,它是評價藥物吸收程度的一個重要指標[8-9]。藥時曲線某一時間區(qū)段下的AUC反映該時間內(nèi)的體內(nèi)藥量,代表了一次給藥后的吸收總量,反映藥物被吸收的程度[11]。本試驗條件下背部澆潑多拉菌素在綿羊體內(nèi)的AUC為(144.7±23.36)ng·d·mL-1,這與張萍等[7]皮下注射于犬上AUC值(187.43±24.99)ng·d·mL-1結果相接近,表明0.5%多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)的吸收較好。
藥物經(jīng)血管外給藥吸收后的血藥濃度最大值稱為藥峰濃度(Cmax),與給藥劑量、給藥途徑、給藥次數(shù)、動物種屬等有關。藥物達到峰濃度所需的時間即為藥峰時間(Tmax),取決于吸收速率和消除速率。兩者是反映藥物吸收快慢的重要指標。本試驗中背部皮膚澆潑多拉菌素于綿羊時的Cmax為(19.93±0.37)ng·mL-1,Tmax為(3.18±0.89)d與Lifschitz等皮下注射于牛上的Tmax值(3.86±1.11)d結果[12]相接近,表明多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)的吸收較快。
本試驗選用AIC法對多拉菌素在綿羊體內(nèi)的房室模型進行判定,即根據(jù)不同的AIC值,可以確定最佳模型。AIC值越小,則該模型擬合度越好,特別是當兩種模型的殘差平方和值很接近時AIC值較小的模型是最適模型。本試驗條件下測出的多拉菌素在綿羊體內(nèi)過程符合二室開放模型,這與張繼瑜等在豬體內(nèi)注射多拉菌素的研究結果[10]相同,而張萍等在犬上注射多拉菌素的動力學模型為一室模型[7],可見動物種屬差異對藥物的動力學特征是有影響的。大環(huán)內(nèi)酯類藥物在動物血漿中的動力學特性可變性較大,這在牛試驗中已得到證明[13],本試驗中多拉菌素在綿羊體內(nèi)的血漿濃度也存在著差異,該結果表明多拉菌素在動物個體內(nèi)吸收和代謝的個體差異性,在相同的試驗條件下,這種現(xiàn)象對伊維菌素在牛、豬、綿羊和山羊中同樣存在,這可能與動物的體況、性別、年齡和生理狀況有關,但與藥物的固有特性關系不大[10]。
綜上,藥物配方組成或給藥途徑不同,可明顯影響藥物的吸收速率,進而影響其生物半衰期和最大血藥濃度。多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)血藥濃度較高,吸收分布迅速,可為臨床用藥提供依據(jù)。
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