楊雨輝，俞觀泉，吳 昊

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海口 570311；2.海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

使用體內(nèi)建立藥動(dòng)學(xué)模型方法評(píng)價(jià)抗菌藥物對(duì)病原菌藥效，可使研究結(jié)果更接近客觀實(shí)際。已有研究者使用動(dòng)物感染模型分析抗菌藥物對(duì)某些人源性病原菌的療效，并以此為依據(jù)獲得一些評(píng)價(jià)抗菌藥物臨床療效的新觀點(diǎn)[1-2]。在獸醫(yī)臨床上，Ramadan等使用綠膿桿菌感染雞的疾病模型進(jìn)行PK-PD的研究，并獲得一些PK-PD參數(shù)[3]，但是這些研究大部分都不能準(zhǔn)確獲得抗菌藥物在感染部位的濃度和細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線[4]。因此需要更好的體內(nèi)模型來進(jìn)行抗菌藥物體內(nèi)藥效研究。

根據(jù)Bengtsson和Creko的研究，使用組織籠模型進(jìn)行體內(nèi)PK-PD研究可解決以上問題，在研究中將藥物直接注射到組織籠中，以克服其他給藥途徑下組織籠內(nèi)藥物濃度變化緩慢的缺點(diǎn)，組織籠也可以直接注射病原菌，進(jìn)行組織籠內(nèi)病原菌數(shù)量變化的的研究。利用該模型研究抗菌藥物體內(nèi)PK-PD關(guān)系是較理想的一種方法[5-6]。本研究利用在豬體內(nèi)安裝組織籠的方法，探討恩諾沙星在組織籠內(nèi)對(duì)大腸桿菌的藥效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及菌種

18頭健康的商品雜交豬（杜洛克×海南豬），體重（59.7±6.3）kg。按常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水和采食，飼料為不含抗菌藥物的全價(jià)日糧。試驗(yàn)前適應(yīng)2周。大腸桿菌2081（44103）為購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.1.2 藥品及培養(yǎng)基

鹽酸恩諾沙星為浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供；乙腈為美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品；四丁基溴化銨均為上海晶純?cè)噭┯邢薰井a(chǎn)品；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 組織籠的準(zhǔn)備及安裝

組織籠的準(zhǔn)備，選取直徑為2.5和3 cm的不銹鋼半球和鋼管，首先將鋼質(zhì)半球用2 mm的鉆頭均勻鉆孔，鉆時(shí)注意保持鉆孔間距為3 mm左右，同時(shí)將直徑為2.5 cm的鋼管截成長(zhǎng)度為3.5 cm的小段，直徑為3 cm的鋼管截成長(zhǎng)度為4 cm的小段，并將直徑相同的鋼管與鉆孔的半球焊接，腔內(nèi)預(yù)先放置4～5粒直徑為3 mm的玻璃珠，打磨表面使其光滑，兩種籠的容積分別約為25和42 mL左右，見圖1。試驗(yàn)前將鋼質(zhì)組織籠洗凈、包扎、滅菌并烘干備用。

圖1 組織籠Fig.1 Tissue cages

組織籠的安裝，選擇試驗(yàn)用健康豬，以普魯卡因（5 g·L-1）在豬的耳后頸部?jī)蓚?cè)進(jìn)行局部浸潤(rùn)麻醉后，分別于兩側(cè)皮膚以無菌手術(shù)分別切開皮膚至岡上肌，形成4～5 cm的小口，鈍性分離，使岡上肌和頸斜方肌之間形成小腔，分別植入一大一小兩個(gè)組織籠并縫合切口。術(shù)后連續(xù)3 d每公斤體重注射青霉素鈉4萬單位，鏈霉素每公斤體重15 mg，每天兩次，防止傷口感染。1周后拆線。2周時(shí)以無菌注射器抽空組織籠內(nèi)組織碎片。5周后手術(shù)部位基本恢復(fù)正常。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與采樣

MIC的測(cè)定，采用雙倍試管稀釋法測(cè)定恩諾沙星對(duì)大腸桿菌的MIC。為了與組織籠內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量一致，本試驗(yàn)測(cè)定MIC時(shí)加入的細(xì)菌量大約是5×107cfu·mL-1。

體內(nèi)PK-PD同步試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，18頭實(shí)驗(yàn)豬，分為三組，每組6頭，每頭具有4個(gè)組織籠，頸部?jī)蓚?cè)分別具有一大一小兩個(gè)組織籠。試驗(yàn)前24 h將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌稀釋10-2后，小籠取1 mL，大籠取1.5 mL（菌液的濃度大約為5×105cfu·mL-1）注射進(jìn)入組織籠，制作一個(gè)感染模型，待細(xì)菌在組織籠內(nèi)孵育24 h后，開始進(jìn)行試驗(yàn)，此時(shí)即為體內(nèi)PD-PK模型的0時(shí)。于試驗(yàn)0時(shí)按照組織籠終濃度為2MIC，5MIC和8MIC，既組織籠藥物內(nèi)藥物終濃度為0.8、2.0、3.2 μg·mL-1的劑量向組織籠注入50 mg·mL-1的恩諾沙星溶液，頸部的一側(cè)作為對(duì)照籠，不注射藥液。分別于試驗(yàn)后0、0.25、0.5、1、3、6、9、12、24、48 h采取組織籠液1 mL，其中0.5 mL進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定，0.5 mL進(jìn)行藥物濃度的測(cè)定。

1.2.3 體內(nèi)抗菌活性的測(cè)定

通過平板菌落計(jì)數(shù)確定組織籠液中活菌數(shù)的變化。

1.2.4 藥物濃度的測(cè)定

采用高效液相色譜對(duì)藥物濃度進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用Winnolin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算，并獲得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

藥效數(shù)據(jù)中的細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)時(shí)間的曲線下面積（AUBKC）計(jì)算根據(jù)兩個(gè)鄰近樣品點(diǎn)所圍成的梯形面積之和進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬組織籠制作結(jié)果

頸部已成功安裝組織籠的豬如圖2所示。安裝完成后傷口愈合完好，可抽出淡黃色清亮的組織液，說明該豬可用于試驗(yàn)研究。

圖2 頸部安裝組織籠的豬Fig.2 Swines assembled the tissue cages

2.2 恩諾沙星在豬組織籠內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征及藥動(dòng)-藥效參數(shù)

在此試驗(yàn)條件下，恩諾沙星對(duì)大腸桿菌的MIC為0.4 μg·mL-1。恩諾沙星在大、小組織籠內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征符合一室模型的藥動(dòng)學(xué)特征，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及藥動(dòng)-藥效參數(shù)參數(shù)見表1。

表1 恩諾沙星在豬不同大小組織籠內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及藥動(dòng)-藥效參數(shù)(X±S，n=6）Table 1 Pharmacokinetic parameters and PK-PD parameters of enrofloxacin in the tissue cage of swine(X±S，n=6）

結(jié)果表明注射相同的藥物濃度后，藥物在小組織籠內(nèi)的半衰期明顯大于在大組織籠內(nèi)的半衰期，差異顯著（P＜0.05），在相同大小的組織籠內(nèi)隨著藥物濃度的增加半衰期表現(xiàn)為增長(zhǎng)。

2.3 恩諾沙星對(duì)豬組織籠內(nèi)細(xì)菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線

恩諾沙星在大組織籠內(nèi)對(duì)大腸桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線見圖3，在大組織籠內(nèi)，無藥對(duì)照籠內(nèi)的細(xì)菌在試驗(yàn)的過程中細(xì)菌的數(shù)量基本上保持恒定，大組織籠內(nèi)注入2MIC的恩諾沙星后，細(xì)菌在被抑制9 h后，出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象，大組織籠內(nèi)注入5MIC或8MIC的恩諾沙星后，細(xì)菌的殺菌曲線幾乎重合，并都在24 h后檢測(cè)不到組織籠內(nèi)細(xì)菌的存在。細(xì)菌在接觸藥物的早期階段下降最為迅速。

恩諾沙星在小組織籠內(nèi)對(duì)大腸桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線見圖4。在小組織籠內(nèi)，無藥對(duì)照籠內(nèi)的細(xì)菌在試驗(yàn)的過程中細(xì)菌的數(shù)量也基本上保持恒定，小組織籠內(nèi)注入2MIC的恩諾沙星后，細(xì)菌在被抑制12 h后，出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象，小組織籠內(nèi)注入5MIC或8MIC的恩諾沙星后，細(xì)菌的殺菌曲線幾乎重合，小籠注入5MIC的藥物濃度后，籠內(nèi)在24 h后檢測(cè)不到細(xì)菌的存在，而注入8MIC藥物濃度的小籠，在注藥12 h后，組織籠內(nèi)就不再能夠檢測(cè)到大腸桿菌的存在。小籠內(nèi)細(xì)菌在接觸藥物的早期階段也表現(xiàn)為迅速下降。

圖3 不同濃度恩諾沙星在大組織籠內(nèi)的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Killing bacteria curve of different concentration enrofloxacin in the big tissue cage

圖4 不同濃度恩諾沙星在小組織籠內(nèi)的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Killing bacteria curve of different concentration enrofloxacin in the small tissue cage

2.4 組織籠內(nèi)細(xì)菌暴露于不同濃度藥物后3 h內(nèi)活菌數(shù)減少值

組織籠內(nèi)細(xì)菌暴露于不同濃度藥物后3 h內(nèi)活菌數(shù)減少的對(duì)數(shù)值見表2。

表2 注射恩諾沙星后在組織籠內(nèi)3h內(nèi)活菌數(shù)減少值（logcfu·mL-1，X±S，n=6）Table 2 Decreasing value of the valid bacteria in 3 hours after injecting enrofloxacin（logcfu·mL-1，X±S，n=6）

在大小組織籠注入不同濃度恩諾沙星，在接觸細(xì)菌3小時(shí)內(nèi)殺滅大腸桿菌的程度比較表明，2MIC與其他各濃度在3 h內(nèi)菌數(shù)減少的lg值之間差異顯著（P＜0.05）。從5MIC到8MIC濃度在3 h內(nèi)菌數(shù)減少的lg值之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 組織籠內(nèi)殺菌動(dòng)力學(xué)曲線下面積(Area under the bacterial kill curve,AUBKC)

不同藥物不同濃度在組織籠內(nèi)殺菌曲線下面積的結(jié)果見表3。對(duì)于恩諾沙星，隨著抗菌藥物的濃度增加，表現(xiàn)為殺菌曲線下面積減少。

表3 不同濃度恩諾沙星在組織籠內(nèi)殺菌曲線下面積(X±S，n=6）Table 3 Area under the bacterial kill curve of different concentration enrofloxacin in tissue cage(X±S，n=6）

3 討論與結(jié)論

3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)于使用組織籠研究抗菌藥物的療效研究，多采用動(dòng)物一側(cè)給藥而另一側(cè)作為對(duì)照的方法進(jìn)行試驗(yàn)[6]。在本研究中，采用此試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要是從給藥的劑量和方式來考慮。兩個(gè)組織籠容積共有67 mL，豬體重60 kg，組織籠容積相對(duì)于豬的體積可以忽略。以組織籠的大小為依據(jù)計(jì)算給藥劑量，藥量少，由于采用直接向組織籠內(nèi)注藥，藥物半衰期相對(duì)很長(zhǎng)。因此，在試驗(yàn)期間進(jìn)入血液藥量較少，而進(jìn)入另一個(gè)組織籠的藥量更少，故可以忽略用藥量對(duì)對(duì)照組織籠內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生的影響，因此本研究采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)可達(dá)到研究目的。

3.2 注射藥物進(jìn)入組織籠的藥動(dòng)學(xué)特征

本研究直接向組織籠內(nèi)注藥，沒有藥物吸收過程，此種給藥方式與靜注給藥的藥動(dòng)過程相仿，因此在進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的計(jì)算時(shí)，采用一室靜注給藥模型進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算。計(jì)算結(jié)果表明所有模擬的相關(guān)系數(shù)R都在0.9以上，說明靜注一室模型可較好地模擬組織籠注射藥物后藥動(dòng)學(xué)特征。

使用組織籠研究抗菌藥物的抗菌效果發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物給藥后，組織籠內(nèi)的藥物濃度上升和下降速度非常緩慢[7-12]，為了克服肌肉注射后，組織籠內(nèi)藥物濃度上升和消除緩慢這一缺點(diǎn)，本研究采用直接向組織籠內(nèi)注射藥物方式進(jìn)行給藥，結(jié)果表明，此方法可以克服肌肉注射給藥后藥物在組織籠內(nèi)濃度較低和半衰期較長(zhǎng)缺點(diǎn)，使得恩諾沙星在組織籠的半衰期較肌肉注射給藥后藥物在組織籠內(nèi)的半衰期降低了近一半[13]，且可以通過控制注射藥物劑量控制組織籠內(nèi)藥物濃度，是目前研究抗菌藥物在動(dòng)物體內(nèi)PK-PD同步關(guān)系較為理想的方法。

在本研究中藥物在小組織籠內(nèi)的半衰期明顯大于在大組織籠內(nèi)的半衰期，差異顯著（P＜0.05），在相同大小的組織籠內(nèi)隨著藥物濃度的增加半衰期表現(xiàn)為增長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道藥物在牛組織籠內(nèi)的半衰期隨著藥物的不同和組織籠大小也存在著差異，在相同大小的組織籠內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，藥物的半衰期增加，這與本研究的結(jié)果相同，但對(duì)于籠的大小與半衰期關(guān)系的結(jié)果卻與本研究相反[5-6]。根據(jù)分析這主要是由于本研究中使用的組織籠大小和形狀設(shè)計(jì)與Greko對(duì)組織籠的大小和形狀設(shè)計(jì)不同導(dǎo)致的。在Greko的研究中，使用的大小組織籠只是長(zhǎng)短上有差異，籠端面積，即籠內(nèi)液體與籠外組織接觸面積是相同的，所以結(jié)果表現(xiàn)為藥物在大籠（長(zhǎng)組織籠）內(nèi)半衰期長(zhǎng)，而在小籠（短組織籠）內(nèi)半衰期短。本研究使用的大小組織籠直徑不同，長(zhǎng)短差異較小，故藥物在小組織籠內(nèi)半衰期長(zhǎng)，而在大組織籠內(nèi)半衰期短的特點(diǎn)。

制作感染籠并直接向組織籠中注入藥物，可以確切了解局部感染用藥后的治療效果，如果已經(jīng)明確某藥物在該局部的藥動(dòng)學(xué)特征，就可以通過改變組織籠的大小和形狀，控制藥物在組織籠內(nèi)的半衰期，使其與該局部的藥動(dòng)學(xué)特征相符。使用此研究方法，對(duì)研究動(dòng)物用藥后某部位的具體療效具有指導(dǎo)作用。

3.3 藥物對(duì)豬組織籠內(nèi)細(xì)菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線

由組織籠內(nèi)細(xì)菌暴露于不同濃度藥物后3 h內(nèi)活菌數(shù)減少值可見，在動(dòng)物組織籠內(nèi)恩諾沙星的藥效與藥物濃度有關(guān)，藥效呈隨濃度增加而增加趨勢(shì)，此規(guī)律在體外模型的研究中已有報(bào)道[16]，說明在豬體內(nèi)恩諾沙星的殺菌規(guī)律與體外結(jié)果一致。由于體內(nèi)條件下還涉及到宿主的免疫因素，因此體內(nèi)試驗(yàn)更接近客觀事實(shí)。

在以前的報(bào)道中，認(rèn)為峰濃度和AUC是氟喹諾酮類藥物發(fā)揮抗菌作用的關(guān)鍵因素，且氟喹諾酮類藥物的peak/MIC比率對(duì)于臨床療效和減少耐藥性是最重要參數(shù)[14-16]。本研究中，大組織籠內(nèi)注入2MIC的恩諾沙星后，細(xì)菌在被抑制9 h后，出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象，大組織籠內(nèi)注入5MIC或8MIC的恩諾沙星后，細(xì)菌的殺菌曲線幾乎重合，這說明5MIC和8MIC的殺菌強(qiáng)度相同，并都在24 h后檢測(cè)不到組織籠內(nèi)細(xì)菌。而在小組織籠內(nèi)注入2MIC的恩諾沙星后，細(xì)菌在被抑制 12 h后，出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象，小籠注入5MIC的藥物濃度后，籠內(nèi)在24 h后檢測(cè)不到細(xì)菌，而注入8MIC藥物濃度的小籠，在注藥12 h后，組織籠內(nèi)就檢測(cè)不到大腸桿菌。由以上結(jié)果表明，當(dāng)藥物濃度較低時(shí)，細(xì)菌可出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象，半衰期決定了藥物出現(xiàn)再生長(zhǎng)的時(shí)間，半衰期長(zhǎng)的出現(xiàn)再生長(zhǎng)的時(shí)間較晚。當(dāng)濃度較高時(shí)細(xì)菌可被完全殺滅，但完全殺滅的時(shí)間也與半衰期有關(guān)，相同的藥物濃度，半衰期長(zhǎng)的殺滅細(xì)菌的速度快。此結(jié)果在體外藥動(dòng)藥效同步模型研究中被發(fā)現(xiàn)[17]，Blaser等在使用體外模型研究依諾沙星對(duì)幾種細(xì)菌的體外藥效時(shí)，也觀察到細(xì)菌的再生長(zhǎng)現(xiàn)象，在所有的peak/MIC比率中，只有peak/MIC＞8，才能避免細(xì)菌在模型內(nèi)的再生長(zhǎng)[18]。本試驗(yàn)中peak/MIC＞5，組織籠內(nèi)的細(xì)菌就不會(huì)出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象。這說明，如果藥物在體內(nèi)消除慢，可以適當(dāng)減少抗菌藥物的用量。恩諾沙星對(duì)大腸桿菌的藥效與濃度有直接關(guān)系，如藥物在感染部位的半衰期長(zhǎng)，用藥量可適當(dāng)減少。

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