劉東旭，時 坤，李健明，杜 銳

（吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118）

鹿結(jié)核病(Deer tuberculosis)是由分枝桿菌(Mycobacterium)引起一種鹿的慢性、消耗性傳染病，其病理特點是在組織器官形成結(jié)核病灶、肉芽腫并發(fā)生干酪樣壞死[1]。無論是野生還是馴化的各品種鹿幾乎均易感。大部分國家的鹿場都曾發(fā)生過結(jié)核病或曾經(jīng)檢出過結(jié)核病菌。

目前，國內(nèi)外尚無防制鹿結(jié)核病的有效方法。在某些國家采取全群診斷、宰殺診斷反應陽性動物的方法[2]。由于鹿是珍貴的經(jīng)濟動物，國內(nèi)，許多養(yǎng)殖戶應用卡介苗（BCG）來預防鹿結(jié)核病。但因卡介苗本身就是減毒牛分枝桿菌[3]，結(jié)核病的診斷，尤其是結(jié)核菌素對診斷結(jié)果產(chǎn)生的干擾，無法準確鑒別疫苗株與自然流行株、疫苗免疫動物與自然感染動物，以至于許多國家不用其對動物進行免疫，阻礙了結(jié)核病防治進程[4]。實踐證明，BCG免疫仍是目前有效預防鹿結(jié)核病的手段[5]。通過抑制性消減雜交篩選出結(jié)核病流行株與卡介苗的差異基因，為建立鹿結(jié)核病自然感染和卡介苗免疫鑒別診斷方法奠定基礎(chǔ)，對促進養(yǎng)鹿業(yè)健康發(fā)展具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體

鹿結(jié)核病野毒株、卡介苗由吉林農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟動物疾病實驗室保存、提供。PCR克隆載體pMD18-T與感受態(tài)細胞JM109購自TaKaRa公司。

1.1.2 試劑

抑制性差減雜交試劑盒PCR-SelectTMBacterial Genome Subtraction Kit（購自美國BD clontech公司）；TaKaRa DNA Fragment Purification Kit（購自TaKaRa公司）；PCR Plus（購自寶泰克生物科技公司）；質(zhì)粒小量試劑盒（購自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司）；Middlebrook 7H9 Broth（購自美國DIFCO公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

將鹿結(jié)核病野毒株及卡介苗分別接種改良羅氏培養(yǎng)基，于37℃保溫箱中培養(yǎng)4～8周，待長出淡黃色不透明形如菜花狀的粗糙菌落后，無菌操作，輕輕刮取少量純培養(yǎng)物置于7H9液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)，待菌液內(nèi)出現(xiàn)絮狀沉淀，取出于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌的基因組提取

將用7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌，85℃滅活后，5 000 r·min-1離心10 min，去上清液。用TE懸浮沉淀，并加0.05 mL 10%SDS，5 μL 20 mg·mL-1蛋白酶K，混勻，37℃保溫1 h。加入0.15 mL 5 mol·L-1NaCl，0.15 mL CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃保溫20 min。用等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，5 000 r·min-1離心10 min，將上清液移至干凈的離心管中。用等體積氯仿：異戊醇（24∶1）抽提，將上清液移至干凈的離心管中。再用1倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止10 min。棄上清液，用70%乙醇漂洗DNA沉淀后，溶解于100 μL TE，采用分光光度計法進行DNA定量檢測后-20℃保存。

1.2.3 抑制性差減雜交

抑制性消減雜交按照Clontech公司的PCRSelectTMBacterial Genome Subtraction Kit說明書進行，具體過程如下：細菌基因組用RsaI酶切后，分別與接頭連接。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌的保守序列IS6110，選取中間不含有RsaI酶切位點的片段，以此為模板設(shè)計連接檢測引物，擴增長度為107 bp的保守片段，引物序列如下：IS6110F引物：5'GTC GCC CGT CTA CTT GGT G 3'IS6110R引物：5'GCG GAT TCT TCG GTC GTG 3'。按照說明書進行連接效率分析。確定連接效率后，進行兩輪差減雜交。其中鹿結(jié)核病野毒株為tester組，卡介苗為driver組。按照說明書對兩輪差減雜交產(chǎn)物進行適當?shù)恼{(diào)整，進行兩次雜交，兩次PCR。進行差減效率的檢測。

1.2.4 差減文庫的構(gòu)建

將第二次PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，取4 μL與pMD18-T載體16℃連接過夜，42℃熱擊轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細胞中，加入800 μL LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)物涂于含有氨芐青霉素/X-Gal/IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，次日觀察藍白色菌落生長情況。

1.2.5 差減文庫的篩選、克隆及鑒定

挑取文庫中白色菌落，接種含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h后，保存菌種并提取質(zhì)粒。以Nester primer 1和Nester primer 2R為引物，進行PCR擴增。反應體系為：模板 1 μL，Nester primer 1 0.5 μL，Nester primer 2R 0.5 μL，PCR Plus 7 μL，DEPC水 16 μL，總體系20 μL。反應程序：94℃預變性10 min，94℃變性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸共30個循環(huán)，72℃10 min后4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌基因組的提取、定量及酶切分析

用紫外分光光度計測定鹿結(jié)核病野毒株和卡介苗的DNA在260和280 nm處的吸光度，其OD260/280比值均在1.8～2.0之間，說明提取的基因組中蛋白質(zhì)和RNA污染較少，純度較高，經(jīng)RsaI酶切后的基因組DNA大小范圍在0.1～2.0 kb之間，成彌散狀分布。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見清晰的DNA條帶，見圖1。

圖1 基因組DNA及酶切產(chǎn)物的電泳檢測Fig.1 Electrophoresis of the DNA by Rsa I restriction enzyme digest and DNA

2.2 接頭連接效率的檢測

為驗證接頭的連接效率，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌復合群保守IS6110設(shè)計特異性引物，預計擴增片段大小107 bp且不含RsaI酶切位點。結(jié)果表明（見圖2），用特異性上游引物與primer 1擴增出的產(chǎn)物（泳道2、4），相比于用特異性引物擴增出的產(chǎn)物（泳道3、5），其亮度相近不低于25%，說明接頭連接的效率較高。

2.3 抑制性差減雜交結(jié)果

兩輪差減雜交后，差異的基因片段兩端帶有不同接頭，鹿結(jié)核病流行株兩次差減后，以第一次PCR產(chǎn)物為模板，Nester primer 1和Nester primer 2R為引物進行PCR擴增。結(jié)果表明（見圖3），消減雜交后的差異基因被富集，在彌散條帶中出現(xiàn)一些清晰條帶。未差減的DNA經(jīng)兩次PCR的產(chǎn)物條帶微弱，且與差減雜交后的基因有顯著差異。

圖2 接頭連接效率PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Result of ligation'efficient of PCR products

圖3 抑制性差減雜交PCR結(jié)果Fig.3 PCR results of DNA subtraction

2.4 差減效率的檢測

以差減雜交第二次PCR產(chǎn)物和未差減雜交第二次PCR產(chǎn)物為模板，以IS6110引物做差減效率檢測，分別在18、22、26、30個循環(huán)時分別取樣5 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明（見圖4、5），未差減組，從在第18個循環(huán)開始出現(xiàn)了107 bp左右的特異性條帶。差減組從第26個循環(huán)開始出現(xiàn)微弱條帶。

圖4 未差減組雜交效率檢測Fig.4 Analysis of efficiency of the unsubtraction

圖5 差減組雜交效率檢測Fig.5 Analysis of efficiency of the subtraction

2.5 差減文庫的構(gòu)建及鑒定

結(jié)果見圖6、7。

圖6 差減雜交文庫中部分隨機克隆的PCR鑒定Fig.6 Part of PCR identification result for subtractive hybridization library

圖7 文庫菌落部分PCR結(jié)果Fig.7 Part of PCR identification result for subtractive hybridization library

差減后PCR產(chǎn)物純化后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細胞中，藍白斑篩選。用Nester primer 1和Nester primer 2R引物進行PCR鑒定，208個克隆獲得了插入片斷，且插入片斷為單一條帶并大于100 bp。

3 討論

篩選出鹿結(jié)核病流行株和卡介苗差異基因是建立鹿結(jié)核病自然感染和卡介苗免疫鑒別診斷方法的基礎(chǔ)。mRNA差異顯示技術(shù)、代表性差異分析法和基因表達系統(tǒng)分析技術(shù)等是20世紀80年代末90年代初問世的篩選差異基因的方法。上述方法的缺點是對低豐度mRNA富集效率低、費時、假陽性高[6-8]。抑制性消減雜交的問世為微生物基因組學研究、致病基因的研究等提供新技術(shù)[9]。Akopyants首次將該方法改良并應用于細菌基因組學研究[10]。抑制性差減雜交是應用抑制性PCR原理[11]，利用兩種接頭,選擇性擴增差異表達的靶片段，抑制非靶片段的擴增。經(jīng)抑制差減雜交后的DNA群體不僅富集了差異表達基因(目的基因)，而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過均等化作用已基本消除，使消減后的DNA群體為豐度一致的目的基因群體。

為了保證抑制性差減雜交的順利進行，在試驗過程中，要選擇合適的內(nèi)切酶對基因組進行酶切，要對酶切效率要進行檢查，只有酶切的片段符合要求，才能保證抑制性差減雜交有效。試劑盒要求，酶切出的片段要小于2 000 bp，本試驗所選用的RsaI限制性內(nèi)切酶可以有效對基因組進行酶切，且酶切后的片段符合試劑盒要求。酶切后的DNA與接頭的連接效率要進行檢測，本試驗采用結(jié)核分枝桿菌的保守序列IS96110，選取中間不含有RsaI酶切位點的片段，以此為模板設(shè)計連接檢測引物，對接頭連接后的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果符合試劑盒要求，說明接頭已連接好，可進行下一步試驗。抑制性差減雜交中差減效率的檢測最為重要，即是否充分除去了試驗組和對照組的相同序列。在本試驗中，用檢測接頭連接效率的引物對差減效率進行檢測，結(jié)果表明差減組與差減對照組相差8個循環(huán)才出現(xiàn)條帶，說明本次試驗的差減成功切效率較高。已初步篩選出卡介苗與鹿結(jié)核菌野毒株的差異基因。

4 結(jié)論

本試驗是以鹿結(jié)核病野毒株和卡介苗為研究對象，以鹿結(jié)核病野毒株為tester組，卡介苗為driver組，tester組，構(gòu)建鹿結(jié)核病野毒株和卡介苗基因組差減文庫，并獲得208個單一的且大于100 bp的片段，這些克隆片段中可能含有鹿結(jié)核病野毒株獨有的特異性的DNA片段。本實驗室正在對這些基因進行鑒定、測序及序列分析，對篩選出具有反應原性的差異基因片段進行表達，對鹿結(jié)核病的防制、鹿結(jié)核病自然感染和卡介苗免疫的鑒別診斷及新型疫苗研制打下基礎(chǔ)，也為人結(jié)核病和牛結(jié)核病防治研究工作提供理論參考。

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