吳 杰，吳樹清，李東興，劉艷琴，張明月，海 巖

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

布魯菌病是由布魯菌屬細菌引起的動物源性疾病，是一種人畜共患傳染性疾病，該病在我國發(fā)病呈逐年上升趨勢［1］。它主要引起人類波狀熱和慢性感染以及反芻動物流產(chǎn)和睪丸炎等，目前尚無根治方法。大量研究表明，布魯菌的外膜蛋白具有很強的免疫原性［2-3］。omp25是布魯菌ompA家族成員之一，omp25基因在布魯菌各個種屬之間有很高的保守性［4］。本試驗克隆了馬耳他布魯菌omp25基因，在大腸埃希菌Rosetta中表達，用純化的表達產(chǎn)物進行Western-blot分析，發(fā)現(xiàn)重組蛋白具有免疫原性。為檢測布魯菌病及研制布魯菌亞單位疫苗提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 馬耳他布魯菌為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室分離株。pET-32a、Rosetta購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試劑 T4連接酶，DNA Marker、蛋白Marker、IPTG和限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、Xho lⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗羊IgG，購自Sigma公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，濃度2OD／管，儲存液濃度100μmol／L。羊種布魯菌陽性血清和標準陰性血清由本實驗室保存，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.3 目的片段的擴增 根據(jù)GenBank上發(fā)表的M16布魯菌的omp25的基因序列設(shè)計馬耳他布魯菌上下游引物P1：5′cgcctcgagttagaacttgtagt 3′，P2：5′ccgggatccatgaaatccgtaat 3′（分別加入Eco RⅠ和Xho lⅠ酶切位點）。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性40s，55℃復(fù)性45s，72℃延伸45s；30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。同時設(shè)去離子水對照。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察結(jié)果。

1.4 omp25基因表達載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、Xho lⅠ雙酶切處理，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收預(yù)期的omp25基因片段與同樣處理的pET-32a表達載體16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至Rosetta中，涂LB平板（氨芐青霉素和氯霉素抗性），37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落37℃過夜搖菌，堿變性法提取質(zhì)粒，進行PCR和Eco RⅠ、Xho lⅠ雙酶切鑒定。挑取陽性單克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，并與GenBank報道的omp25基因序列進行同源性比較。將重組質(zhì)粒命名為pET-32a-omp25。

1.5 pET-32a-omp25重組蛋白的誘導(dǎo)表達 含重組質(zhì)粒的菌液按1∶100的量接種在LB培養(yǎng)基中（含氨芐青霉素，氯霉素50μg／mL），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.6～1.0，再加入IPTG使其終濃度達到1mmol／L。37℃繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)12%分離膠檢測表達情況。

1.6 表達產(chǎn)物的純化和Western-blot檢測 將上述的誘導(dǎo)表達樣品以10000r／min離心收集菌體，沉淀物用原收集菌液量1／5體積的PBS懸浮，置冰浴中超聲波處理10min，10000r／min（4℃）離心10 min，分別收集上清和沉淀。按照His GraviTrap和His GraviTrap Kit的說明書，對融合蛋白進行重力流純化，對純化產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析。將純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE后再轉(zhuǎn)到NC膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，PBST緩沖液洗3次，加入布魯菌病陽性血清（1∶100倍稀釋）37℃作用2h，PBST緩沖液洗3次，再加入兔抗羊IgG辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體（1∶2000倍稀釋），37℃作用1h，PBST緩沖液洗3次，DAB顯色液中避光顯色2～10min。

2 結(jié)果

2.1 pET-32a-omp25重組質(zhì)粒的鑒定 pET-32aomp25重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和Eco RⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，得到了預(yù)期大小的642bp片段。測序結(jié)果表明，目的基因omp25正向插入pET-32a載體（見圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pET-32a-omp25的PCR及雙酶切鑒定

2.2 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE分析結(jié)果表明，經(jīng)1mmol／L的IPTG誘導(dǎo)的5h基因工程菌獲得表達，產(chǎn)生約43kDa的特異性蛋白條帶（見圖2）。

圖2 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE

2.3 表達產(chǎn)物的純化及Western-blot檢測結(jié)果純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明獲得了高純度的目的蛋白。Western-blot分析結(jié)果表明，表達的目的蛋白能與馬耳他布魯菌陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，43kDa處出現(xiàn)特異免疫反應(yīng)條帶（見圖3）。

圖3 表達產(chǎn)物純化的SDS-PAGE及Western-blot分析

3 討論

omp25是布魯菌外膜結(jié)構(gòu)蛋白［5］，是具有代表性的第3組外膜蛋白［6］。在布魯菌各個種屬之間具有高度的保守性，同源性達98%以上。布魯菌omp25基因的缺失可引起布魯菌的毒力減弱，并能夠?qū)λ拗髌鸬矫庖弑Ｗo作用［7］。Philpper從B.abortus544基因庫中，以抗omp25單克隆抗體調(diào)出了omp25基因，并分析了其脫氧核糖核苷酸序列omp25基因長約917bp，在起始密碼子6個堿基前有7個核苷酸序列（TAAGGAG）與大腸桿菌16sRNA序列具有同源性，估計是核糖體結(jié)合位點。布魯菌細胞壁膜結(jié)構(gòu)是大多數(shù)細菌識別宿主的獨特標志物，能綁定胞外的許多基質(zhì)蛋白，特別是纖維連接素和玻璃體粘連蛋白，這也是許多其他的病原微生物普遍存在的一個屬性。研究證實布魯菌表面主要的抗原成分是LPS和omps。到目前為止，己發(fā)現(xiàn)有7種主要omps［8］，它以共價鍵的形式與細胞外膜的膚聚糖（PG）層緊密結(jié)合。

本試驗證實omp25蛋白表達量高，占總菌體蛋白的含量高，具有良好的免疫反應(yīng)原性，具備作為免疫學(xué)活性抗原的潛力和優(yōu)勢，為疫苗的開發(fā)和免疫學(xué)檢測方法的建立提供了候選抗原。

［1］文學(xué)忠，于瑞華，姜秋杰.布魯氏菌病近況［J］.吉林畜牧獸醫(yī)，2007，5：20-23.

［2］Bowden R A，Cloeckaert A，Zygmunt M S，et al.Evaluation of immunogenicity and protective activity in BALB／c mice of the 25-kDa major outer-membrane protein of Brucella melitensis（OMP25）expressed in Escherichia coli［J］.J Med Micobiol，1998，47：39-48.

［3］Brocker B J，Tabatabai L B，Mayfeld J E.Conserbation of antigenicityin a 31-kDa Brucella protein［J］.Vet Microbiol，1998，18：313-525.

［4］Matthew D，Edmonds，Cloeckaert A，et al.Brucella species lacking the major outer membrane protein Omp25are attenuated in mice and protect against Brucella ovis［J］.Vet Micobiol，2002，88：205-221.

［5］Bowden R A，Verger J M，Grayon M，et al.Rspid identification of rough Brucella isolates bu a latex coagglutination assay with the 25-lilodalton outer membrane protein and rough-lipopolysaccharide specific monoclonal antibodies［J］.Clin Diagn Lsb Innunol，1997，4（5）：611-614.

［6］Oliveira S C，Splitter G A.Immunization of mice with recombinant L7／L12ribosomal protein confers protein confers protection against Brucella abortus infection［J］.Vaccine，1996，14（10）：959-962.

［7］Edmonds M D，Cloeckaert A，Booth N J，et al.Attenuation of a Brucella abortus mutant lacking a major 25kDa outer membrane protein in cattl［J］.Ameri J Vet Res，2001，62（9）：1461-1466.

［8］Cloeckaert A，Zymunt M S，Wergifosse P，et al.Demonstration of pertidoglycan-associated Brucella outer-membrane proteins by use of monoclonal antibodies［J］.J Gen Microbiol，1992（138）：1543-1550.