蘇海峰，蔣 月，徐國鋒，王磊杰，張 陸，張秀英

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 錦州 121000）

大腸桿菌存在于人和動物的腸道內(nèi)，正常情況下為非致病性共棲菌，特殊條件下（如人體虛弱、免疫力降低或胃腸受損等）具有致病性，會導致大腸桿菌病的發(fā)生。豬大腸桿菌病就是由致病性大腸桿菌引起豬的一種急性傳染病，根據(jù)其病原、臨床癥狀、病理剖檢及流行病學特征的不同，可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

抗微生物藥物在有效遏制豬類各種大腸桿菌感染的同時，也造成了大腸桿菌的嚴重耐藥狀況，耐藥菌株增加，耐藥機制趨于復雜［1］。耐藥基因在菌株之間的傳遞。菌株耐藥譜逐年變寬，甚至某些地區(qū)出現(xiàn)耐24種藥物的菌株［2］。因而在臨床用藥中應以細菌耐藥性調(diào)查作為科學依據(jù)，這樣不僅能減少了耐藥性的擴散，對公共衛(wèi)生意義也很重大［3］。

本文通過對發(fā)病豬群進行采樣、分離鑒定、致病性試驗等分離出致病性大腸桿菌，并對其進行耐藥性試驗，對其耐藥性及耐藥譜進行分析，探討該地區(qū)致病性大腸桿菌耐藥性現(xiàn)狀，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。大腸桿菌臨床分離株：分離自哈爾濱市周邊地區(qū)規(guī)?；i場患黃白痢仔豬的直腸拭子。

1.2 培養(yǎng)基與試劑 試驗用麥康凱瓊脂、水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂）等各種常規(guī)培養(yǎng)基以及葡萄糖等微量生化反應管（生產(chǎn)批號：20110315），均購自杭州天和微生物試劑有限公司。試驗用14種藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司。

1.3 實驗動物 試驗用小鼠，購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.4 分離純化 將所采集的直腸拭子加入肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～24h，取少量菌液于麥康凱培養(yǎng)基畫板，37℃培養(yǎng)24h，挑取圓潤粉紅色菌落進行純培養(yǎng)。

1.5 鑒定

1.5.1 鏡檢 取少量純培養(yǎng)細菌菌液進行革蘭染色，并于顯微鏡下觀察細菌形態(tài)，進行初步判斷。

1.5.2 生化鑒定 根據(jù)陸承平［7］的方法，使用以下生化反應管，即葡萄糖、乳糖、蔗糖、肌糖、木糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸、V-P、M.R.，對分離株進行鑒定。

1.6 致病性試驗 分離株搖床培養(yǎng)12h，將培養(yǎng)液以生理鹽水稀釋至5×108CFU／mL，并以0.01 mL／g體重的接種量接種小鼠腹腔，觀察小鼠死亡情況，對分離株致病性進行判定。

1.7 藥敏試驗 按照世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的Kirby-Bauer法進行［6］，每次試驗前用標準菌株ATCC25922進行質(zhì)控，藥敏試驗結果參照CLSI（2007）［7］判定標準進行。見表1。

表1 藥敏試驗判定標準

2 結果

2.1 分離純化及鑒定 細菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色菌落。顯微鏡下菌體呈兩端鈍圓，革蘭染色陰性。生化試驗結果見表2。

對照陸承平著書中［5］判定結果進行判定，符合大腸桿菌的生化特征。

2.2 致病性試驗結果 對接種28株大腸桿菌培養(yǎng)物的小鼠進行觀察，36h內(nèi)全部死亡。

2.3 藥敏試驗結果

2.3.1 28株豬源致病性大腸桿菌14種抗菌藥物抑菌圈及耐藥率結果 見表3。

2.3.2 耐藥率分布 各種藥物耐藥率分布情況見圖1。以鏈霉素、氟苯尼考和復方新諾明的耐藥率最高，均在85%以上。磷霉素和多黏菌素B耐藥率最低，均低于4%。

表2 細菌生化鑒定結果

表3 28株豬源致病性大腸桿菌耐藥試驗

圖1 28株細菌對14種抗菌藥的耐藥率

2.3.3 耐藥表型 所分離的28株致病性大腸桿菌中存在25個耐藥表型，見表4。

2.3.4 多重耐藥性 細菌多重耐藥情況見圖2。細菌多重耐藥數(shù)以6耐和7耐最多，8耐次之；最少3耐，最高12耐。

表4 28株致病性大腸桿菌的耐藥表型

圖2 28株豬源致病性大腸桿菌多重耐藥情況

3 分析與討論

3.1 豬源致病性大腸桿菌的耐藥情況分析 本試驗分析了從哈爾濱周邊地區(qū)分離的28株豬源致病性大腸桿菌對14種獸醫(yī)臨床常用的抗菌藥物的敏感性。結果顯示，豬源大腸桿菌分離菌株耐藥水平不斷提高，多重耐藥現(xiàn)象嚴重。除對多黏菌素B和磷霉素敏感率較高外，對目前常用和應用時間較長的抗菌藥物，如鏈霉素、復方新諾明、氟苯尼考、慶大霉素、多西環(huán)素、氯霉素等產(chǎn)生了非常嚴重的耐藥性；所有菌株均呈多重耐藥，其中最少的耐藥3種，最多的耐藥12種。產(chǎn)生這種多重耐藥現(xiàn)象的原因可能是：致病性大腸桿菌在藥物的選擇性壓力下耐藥基因發(fā)生突變，適用了環(huán)境壓力而產(chǎn)生耐藥性［8］；臨床上濫用抗生素，大腸桿菌可通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動元件獲得耐藥性［9］。另外，細菌對多黏菌素B耐藥率較低，敏感率較高，可為臨床用藥提供一定的指導作用。

在28株大腸桿菌中出現(xiàn)25個耐藥表型，多重耐藥現(xiàn)象嚴重，耐藥表型復雜，這可能和不同養(yǎng)殖場的用藥史及用藥習慣有關，提示臨床用藥應根據(jù)藥敏試驗結果選擇治療用抗菌藥物。

3.2 耐藥性現(xiàn)狀 本試驗結果與宋立等對不同年代食品動物大腸桿菌耐藥性調(diào)查研究所顯示的趨勢大致相同，細菌多重耐藥數(shù)大幅度增加［10］。但青霉素、氯霉素等藥物耐藥率增長略有不同，這可能和不同地區(qū)，用藥種類不同所致［11］。本試驗大腸桿菌耐藥情況結果與丁良君等報道相比，阿莫西林、氯霉素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星耐藥率均降低28.57%～50.71%，其中環(huán)丙沙星降低最多（50.71%），磺胺甲噁唑、鏈霉素耐藥率基本不變，多西環(huán)素、多黏菌素B耐藥率分別增加15%、14.29%［12］。這可能和豬場改變常用藥物有關。值得一提的是，氯霉素在禁用之后，耐藥率由原來的100%降低到71.43%。提示在停止使用抗生素一定時間后，細菌可能逐漸恢復對其敏感性。由此可見，規(guī)范使用抗生素對于減緩細菌耐藥性的擴散和傳播具有重要的實際意義。

［1］馬紅霞，劉玉堂，傘治豪.不同動物源性大腸桿菌多重耐藥調(diào)控基因rob的同源性分析［J］.中國獸醫(yī)科學，2007，37（12）：1035-1040.

［2］陳雅莉.四川省食品動物源性大腸桿菌耐藥性監(jiān)測及整合子—基因盒檢測［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2010.

［3］賴婧，劉洋，汪宇，等.800株不同動物源大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測［J］.中國獸醫(yī)雜志，2011，47（4）：12-14.

［4］夏倫斌，左瑞華，余道倫，等.規(guī)?；i場致病性大腸桿菌的耐藥性分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（6）：183-185.

［5］陸承平.獸醫(yī)微生物學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：215-223.

［6］Khan A，Dass C，Ramamurthy T，et al.Antibiotic resistance，virulence gene，and molecular profiles of Shiga toxin producing Escherichia coli isolates from diverse sources in Calcutta［J］.J Clin Microbiol，2002，40（6）：2009-2015.

［7］CLSI M31-A3，Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals［S］.

［8］Hongxia Jiang，Zhangliu Chen，Xiumei Wang，et al.High prevalence and widespread distribution of multi-resistant Escherichia coli isolates in pigs and poultry in China［J］.The Veterinary Journal，2011，187：99-103.

［9］Liming Lu，Lei Dai，Yang Wang，et al.Characterization of antimicrobial resistance and integrons among Escherichia coli isolated from animal farms in Eastern China［J］.Acta Tropica，2010，113：20-25.

［10］宋立，寧宜寶，沈建忠，等.中國不同年代食品動物大腸桿菌耐藥性調(diào)查研究［J］.中國科學，2009，39（7）：692-698.

［11］De Jong A，Bywater R，Butty P，et al.A pan-European survey of antimicrobial susceptibility towards human-use antimicrobial drμgs among zoonotic and commensal enteric bacteria isolated from healthy food-producing animals［J］.Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2009，63（4）：733-744.

［12］丁良君，張秀英，付銳，等.大腸埃希菌Ⅰ類整合子與多重耐藥的相關個性分析［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2007，38（6）：771-774.