蘇海峰，蔣 月，徐國(guó)鋒，王磊杰，張 陸，張秀英

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

大腸桿菌存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，正常情況下為非致病性共棲菌，特殊條件下（如人體虛弱、免疫力降低或胃腸受損等）具有致病性，會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌病的發(fā)生。豬大腸桿菌病就是由致病性大腸桿菌引起豬的一種急性傳染病，根據(jù)其病原、臨床癥狀、病理剖檢及流行病學(xué)特征的不同，可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

抗微生物藥物在有效遏制豬類(lèi)各種大腸桿菌感染的同時(shí)，也造成了大腸桿菌的嚴(yán)重耐藥狀況，耐藥菌株增加，耐藥機(jī)制趨于復(fù)雜［1］。耐藥基因在菌株之間的傳遞。菌株耐藥譜逐年變寬，甚至某些地區(qū)出現(xiàn)耐24種藥物的菌株［2］。因而在臨床用藥中應(yīng)以細(xì)菌耐藥性調(diào)查作為科學(xué)依據(jù)，這樣不僅能減少了耐藥性的擴(kuò)散，對(duì)公共衛(wèi)生意義也很重大［3］。

本文通過(guò)對(duì)發(fā)病豬群進(jìn)行采樣、分離鑒定、致病性試驗(yàn)等分離出致病性大腸桿菌，并對(duì)其進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，對(duì)其耐藥性及耐藥譜進(jìn)行分析，探討該地區(qū)致病性大腸桿菌耐藥性現(xiàn)狀，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。大腸桿菌臨床分離株：分離自哈爾濱市周邊地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)患黃白痢仔豬的直腸拭子。

1.2 培養(yǎng)基與試劑 試驗(yàn)用麥康凱瓊脂、水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂）等各種常規(guī)培養(yǎng)基以及葡萄糖等微量生化反應(yīng)管（生產(chǎn)批號(hào)：20110315），均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。試驗(yàn)用14種藥敏紙片，購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用小鼠，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 分離純化 將所采集的直腸拭子加入肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～24h，取少量菌液于麥康凱培養(yǎng)基畫(huà)板，37℃培養(yǎng)24h，挑取圓潤(rùn)粉紅色菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.5 鑒定

1.5.1 鏡檢 取少量純培養(yǎng)細(xì)菌菌液進(jìn)行革蘭染色，并于顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，進(jìn)行初步判斷。

1.5.2 生化鑒定 根據(jù)陸承平［7］的方法，使用以下生化反應(yīng)管，即葡萄糖、乳糖、蔗糖、肌糖、木糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸、V-P、M.R.，對(duì)分離株進(jìn)行鑒定。

1.6 致病性試驗(yàn) 分離株搖床培養(yǎng)12h，將培養(yǎng)液以生理鹽水稀釋至5×108CFU／mL，并以0.01 mL／g體重的接種量接種小鼠腹腔，觀察小鼠死亡情況，對(duì)分離株致病性進(jìn)行判定。

1.7 藥敏試驗(yàn) 按照世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行［6］，每次試驗(yàn)前用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922進(jìn)行質(zhì)控，藥敏試驗(yàn)結(jié)果參照CLSI（2007）［7］判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。見(jiàn)表1。

表1 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 分離純化及鑒定 細(xì)菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色菌落。顯微鏡下菌體呈兩端鈍圓，革蘭染色陰性。生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)照陸承平著書(shū)中［5］判定結(jié)果進(jìn)行判定，符合大腸桿菌的生化特征。

2.2 致病性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)接種28株大腸桿菌培養(yǎng)物的小鼠進(jìn)行觀察，36h內(nèi)全部死亡。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 28株豬源致病性大腸桿菌14種抗菌藥物抑菌圈及耐藥率結(jié)果 見(jiàn)表3。

2.3.2 耐藥率分布 各種藥物耐藥率分布情況見(jiàn)圖1。以鏈霉素、氟苯尼考和復(fù)方新諾明的耐藥率最高，均在85%以上。磷霉素和多黏菌素B耐藥率最低，均低于4%。

表2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

表3 28株豬源致病性大腸桿菌耐藥試驗(yàn)

圖1 28株細(xì)菌對(duì)14種抗菌藥的耐藥率

2.3.3 耐藥表型 所分離的28株致病性大腸桿菌中存在25個(gè)耐藥表型，見(jiàn)表4。

2.3.4 多重耐藥性 細(xì)菌多重耐藥情況見(jiàn)圖2。細(xì)菌多重耐藥數(shù)以6耐和7耐最多，8耐次之；最少3耐，最高12耐。

表4 28株致病性大腸桿菌的耐藥表型

圖2 28株豬源致病性大腸桿菌多重耐藥情況

3 分析與討論

3.1 豬源致病性大腸桿菌的耐藥情況分析 本試驗(yàn)分析了從哈爾濱周邊地區(qū)分離的28株豬源致病性大腸桿菌對(duì)14種獸醫(yī)臨床常用的抗菌藥物的敏感性。結(jié)果顯示，豬源大腸桿菌分離菌株耐藥水平不斷提高，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。除對(duì)多黏菌素B和磷霉素敏感率較高外，對(duì)目前常用和應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)的抗菌藥物，如鏈霉素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、慶大霉素、多西環(huán)素、氯霉素等產(chǎn)生了非常嚴(yán)重的耐藥性；所有菌株均呈多重耐藥，其中最少的耐藥3種，最多的耐藥12種。產(chǎn)生這種多重耐藥現(xiàn)象的原因可能是：致病性大腸桿菌在藥物的選擇性壓力下耐藥基因發(fā)生突變，適用了環(huán)境壓力而產(chǎn)生耐藥性［8］；臨床上濫用抗生素，大腸桿菌可通過(guò)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)元件獲得耐藥性［9］。另外，細(xì)菌對(duì)多黏菌素B耐藥率較低，敏感率較高，可為臨床用藥提供一定的指導(dǎo)作用。

在28株大腸桿菌中出現(xiàn)25個(gè)耐藥表型，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，耐藥表型復(fù)雜，這可能和不同養(yǎng)殖場(chǎng)的用藥史及用藥習(xí)慣有關(guān)，提示臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇治療用抗菌藥物。

3.2 耐藥性現(xiàn)狀 本試驗(yàn)結(jié)果與宋立等對(duì)不同年代食品動(dòng)物大腸桿菌耐藥性調(diào)查研究所顯示的趨勢(shì)大致相同，細(xì)菌多重耐藥數(shù)大幅度增加［10］。但青霉素、氯霉素等藥物耐藥率增長(zhǎng)略有不同，這可能和不同地區(qū)，用藥種類(lèi)不同所致［11］。本試驗(yàn)大腸桿菌耐藥情況結(jié)果與丁良君等報(bào)道相比，阿莫西林、氯霉素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星耐藥率均降低28.57%～50.71%，其中環(huán)丙沙星降低最多（50.71%），磺胺甲噁唑、鏈霉素耐藥率基本不變，多西環(huán)素、多黏菌素B耐藥率分別增加15%、14.29%［12］。這可能和豬場(chǎng)改變常用藥物有關(guān)。值得一提的是，氯霉素在禁用之后，耐藥率由原來(lái)的100%降低到71.43%。提示在停止使用抗生素一定時(shí)間后，細(xì)菌可能逐漸恢復(fù)對(duì)其敏感性。由此可見(jiàn)，規(guī)范使用抗生素對(duì)于減緩細(xì)菌耐藥性的擴(kuò)散和傳播具有重要的實(shí)際意義。

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