歐陽召，王春梅，陶 志

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥系，北京 100102）

蛹蟲草Cordyceps militaris(L.)Link.，又稱北冬蟲夏草，為蟲草屬中的重要一種。經(jīng)研究證明，蛹蟲草中所含有的蟲草素具有多種生理活性，如抑菌、抗腫瘤、抑制病毒，以及增強(qiáng)免疫功能、防治心腦血管疾病等功能[1-3]。目前，蛹蟲草生產(chǎn)仍以固體栽培收獲子實(shí)體為主，蟲草素也主要靠從蛹蟲草子實(shí)體中提取獲得，然而子實(shí)體培養(yǎng)有一定難度，子實(shí)體生產(chǎn)周期長，且蟲草素從蛹蟲草子實(shí)體中提取、分離工藝繁瑣、復(fù)雜，從而大大增加了蟲草素的生產(chǎn)成本[1]。蛹蟲草液體發(fā)酵則具有周期短、活性物質(zhì)易于提取等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于蛹蟲草發(fā)酵培養(yǎng)的研究，前期的工作多集中于獲得較多的菌絲體[4]，較少報(bào)道以提高蟲草素含量為目標(biāo)的培養(yǎng)研究。為了提高蛹蟲草液體發(fā)酵中蟲草素的含量，本文從發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件兩個(gè)方面入手，對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵中蟲草素積累的影響因素進(jìn)行研究，為工業(yè)化高效生產(chǎn)蟲草素提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蛹蟲草菌種購自中國科學(xué)院微生物研究所，菌種編號(hào)為5.0700，培養(yǎng)保藏于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥系。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基

采用PDA綜合培養(yǎng)基。

1.2.2 液體發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基

在檢索文獻(xiàn)所得到培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了以下5種液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

1號(hào)：蛋白胨 15 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、磷酸二氫鉀1 g·L-1、 七水合硫酸鎂 0.5 g·L-1、 VB110 mg·L-1、 萘乙酸2 mg·L-1。

2號(hào)：蛋白胨 15 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、磷酸二氫鉀1.5 g·L-1、 七水合硫酸鎂 0.5 g·L-1、 VB15 mg·L-1、 萘乙酸2 mg·L-1。

3號(hào)：蛋白胨 20 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、七水合硫酸鎂 0.5 g·L-1、 磷酸二氫鉀 1 g·L-1、 萘乙酸 4 mg·L-1。

4號(hào)：蔗糖 40 g·L-1、蛋白胨15 g·L-1、七水合硫酸鎂0.5 g·L-1、 磷酸二氫鉀 0.5 g·L-1、 萘乙酸 4 mg·L-1。

5號(hào)： 葡萄糖 20 g·L-1、 馬鈴薯（煮汁） 200 g·L-1、 磷酸二氫鉀 2 g·L-1[5]。

1.3 方法

1.3.1 固體培養(yǎng)方法

按PDA綜合培養(yǎng)基配方配制，高壓滅菌后制斜面，將保藏的菌種接入新制的培養(yǎng)基中，將接好的菌種置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，至潔白的菌絲體長滿試管斜面為度。

1.3.2 液體發(fā)酵方法

將PDA斜面培養(yǎng)基上經(jīng)過活化的蛹蟲草菌種，接入上述5種液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵（250 mL搖瓶裝100 mL培養(yǎng)基），在25℃、130 r·min-1、光照12 h的條件下培養(yǎng)，進(jìn)行一級(jí)發(fā)酵，使菌種適應(yīng)新環(huán)境，在出現(xiàn)大量松散的小米粒樣的菌絲球時(shí)一級(jí)發(fā)酵完成。將得到的一級(jí)種子定量接入新的培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)15 d（預(yù)實(shí)驗(yàn)證明第15天時(shí)，發(fā)酵液中蟲草素的含量不再發(fā)生明顯變化)，得到二級(jí)發(fā)酵產(chǎn)物。

1.3.3 發(fā)酵液中蟲草素含量鑒定

對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行提取。發(fā)酵液12000 r·min-1離心，15 min后取上清，醇沉蒸干后，甲醇洗下得到樣品。 蟲草素含量鑒定用薄層色譜法[6]（色譜條件：薄層板 GF254硅膠板； 展開劑∶氯仿∶乙酸乙酯∶異丙醇∶水=8∶2∶6∶0.5，每10毫升展開劑加2滴～4滴氨水，蟲草素對(duì)照品濃度為1 mg·mL-1，定量點(diǎn)樣），鑒定各樣品中蟲草素的含量，根據(jù)薄層板上蟲草素斑點(diǎn)的大小來鑒別蟲草素的含量，從而據(jù)此來選擇發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.4 液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)選

在確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基后，為確定蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)生蟲草素的最優(yōu)發(fā)酵條件，設(shè)計(jì)了正交實(shí)驗(yàn)，見表1、表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 L9（33）正交實(shí)驗(yàn)安排表

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

得到的圖片以Quantity one軟件對(duì)顯色點(diǎn)進(jìn)行分析，點(diǎn)光密度曲線下面積為相對(duì)含量，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選結(jié)果

5種發(fā)酵培養(yǎng)基分別記作1號(hào)到5號(hào)，在相同條件下進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵一定時(shí)間后提取并進(jìn)行薄層鑒別，以蟲草素的含量為指標(biāo)，結(jié)果見圖1。

由薄層色譜結(jié)果可知，1號(hào)培養(yǎng)基較適合蟲草素積累，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，故選擇其作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)選結(jié)果

用優(yōu)選好的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，在發(fā)酵第15天時(shí)進(jìn)行提取操作，薄層色譜法鑒定各發(fā)酵條件下發(fā)酵液中蟲草素的含量，見圖2。

圖2結(jié)果顯示，1號(hào)～3號(hào)有相對(duì)較少的蟲草素積累；4號(hào)～6號(hào)有相對(duì)較多的蟲草素積累，其中5號(hào)蟲草素含量最高；7號(hào)～9號(hào)無蟲草素積累。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，25℃適合蟲草素積累；正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳條件為pH7，溫度25℃，光照12 h。

3 結(jié)論與討論

已經(jīng)有較多的工作對(duì)蛹蟲草的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究[4，7-9]，但多數(shù)研究關(guān)注的點(diǎn)是提高蟲草菌絲的生長量，而以提高蟲草素含量為目標(biāo)，探討蛹蟲草的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究較少見。通過蛹蟲草生產(chǎn)蟲草素具有很好的商業(yè)前景[1]，因此，本文側(cè)重點(diǎn)在于確定產(chǎn)生較多蟲草素的蛹蟲草培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。

本研究國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)，光照對(duì)于蟲草素的產(chǎn)生至關(guān)重要，沒有光照蟲草素不能產(chǎn)生（圖2），可能蟲草素的產(chǎn)生與光敏調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)。傳統(tǒng)蛹蟲草的培養(yǎng)認(rèn)為菌絲體的生長應(yīng)該在黑暗中進(jìn)行[4]，另有研究認(rèn)為光照抑制菌絲體的生長[9]，本實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為無光培養(yǎng)不適合以蟲草素的生產(chǎn)為目的的培養(yǎng)。關(guān)于光照與蟲草素產(chǎn)生的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行深入研究，結(jié)果將另文發(fā)表。

本實(shí)驗(yàn)采用二級(jí)液體發(fā)酵，進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵的目的是使斜面菌種適應(yīng)新的培養(yǎng)基環(huán)境，一級(jí)發(fā)酵在進(jìn)行到第5天時(shí)菌絲球大量產(chǎn)生，生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期，此時(shí)菌種活力最旺盛，接入二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液中可進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明在二級(jí)發(fā)酵進(jìn)行到第15天左右時(shí)，蟲草素積累至一定程度，蟲草素含量不再發(fā)生明顯變化，終止發(fā)酵。使用薄層色譜法進(jìn)行半定量分析，在保證發(fā)酵液體積相等、操作提取條件相同、所加甲醇體積相同以及點(diǎn)樣量相同等平行操作條件下，可以反映各種發(fā)酵液中蟲草素的含量，本實(shí)驗(yàn)及重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，1號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基是適合蟲草素積累的優(yōu)良培養(yǎng)基。在優(yōu)選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出了適合蟲草素積累的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件，其也較適合蟲草素的積累。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，蛹蟲草液體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為蛋白胨 15 g·L-1、 葡萄糖 20 g·L-1、 磷酸二氫鉀 1 g·L-1、 七水合硫酸鎂 0.5 g·L-1、 VB110 mg·L-1、 萘乙酸 2 mg·L-1；蛹蟲草液體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)條件為發(fā)酵液pH7，培養(yǎng)溫度25℃，光照時(shí)間12 h。在優(yōu)選出的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下發(fā)酵液中蟲草素積累量較高。本研究的數(shù)據(jù)對(duì)于工業(yè)上利用蛹蟲草高效生產(chǎn)蟲草素，如何選擇培養(yǎng)基和確定培養(yǎng)條件提供參考和依據(jù)。

[1]楊濤，董彩虹.蟲草素的研究開發(fā)現(xiàn)狀與思考[J].菌物學(xué)報(bào)，2011，30(2)：37-47.

[2]張平，朱述鈞，錢大順，等.北冬蟲夏草功能成分及保健作用分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003(6)：105-107.

[3]李祝，劉愛英，梁宗琦.蟲草菌素的生物活性及檢測(cè)方法[J].食用菌學(xué)報(bào)，2002，9(1)：57，62.

[4]何洋，劉林德，趙彥宏，等.蛹蟲草優(yōu)化培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].魯東大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，27(1)：64-67.

[5]周洪波，肖升木，阮承超，等.蛹蟲草液體的深層發(fā)酵[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，37(6)：1098-1102.

[6]劉靜明，劉岱，楊立新，等.蛹蟲草菌絲與冬蟲夏草中核苷類成分的含量測(cè)定[J].中國中藥雜志，1994，19 (10)：615-616.

[7]秦秀麗，周淑榮.蛹蟲草液體培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)研究[J].特產(chǎn)研究，2010 (3)：30-33.

[8]程紅艷，郭偉，常明昌，等.蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，31(1)：66-72.

[9]宋仙妹，常繼東.蛹蟲草菌絲體培養(yǎng)特性的研究[J].食用菌，2008(3)：12-14.