張 姝，莫 非，張 然，孫朝琴，王 瑩，李 寅，羅昭遜，夏曙華（貴陽醫(yī)學(xué)院臨床檢驗教研室，貴陽550004）

幽門螺桿菌（Hp）是慢性胃炎、消化性潰瘍的重要致病因素，與胃癌和胃黏膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。目前使用抗菌藥物根除Hp感染是治療Hp相關(guān)性胃炎、消化性潰瘍的主要方法。抗菌藥物的廣泛使用使Hp對抗菌藥物的耐藥性不斷升高，其中對甲硝唑（MTZ）的耐藥性尤為突出[2]。國外有學(xué)者Goodw in等[3]報道，Hp的編碼基因（rdxA）變異與甲硝唑耐藥有一定關(guān)系，但Hp對甲硝唑的耐藥機制目前尚未完全明確。細胞毒素相關(guān)基因A（cagA）編碼的產(chǎn)物是Hp重要的毒力因子，不僅與Hp致病及相關(guān)疾病臨床嚴重程度有關(guān)，還可能與甲硝唑的耐藥性有關(guān)，但是相關(guān)關(guān)系目前尚有分歧。由于基因本身的多態(tài)性和藥物選擇壓力下的遺傳多樣性，單純的聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）難以完全闡明基因中的復(fù)雜信息。為了觀察DNA中堿基突變，本試驗對從貴陽某醫(yī)院60例消化內(nèi)科患者胃黏膜標本中分離出的11株Hp的rdxA和cagA基因進行PCR擴增并測序，與國際標準株Hp26695堿基序列比對，探討二者堿基突變與甲硝唑耐藥性的關(guān)系。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Chem iDoc XRS凝膠儀（美國Bio-Rad公司）；PCR擴增儀（美國Applied biosystems公司）；DNA提取試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司）。

1.2 試藥

哥倫比亞血瓊脂（英國Oxoid公司）；脫纖維羊血（廣州蕊特生物科技有限公司）；甲硝唑E試驗（E-test）試紙條和微需氧袋（法國生物梅里埃公司）；萬古霉素、兩性霉素、多粘霉素、三甲氧芐氨嘧啶（TMP）原料藥（美國Sigma公司，批號：V2002、A9528、S0414、T7883，純度均為：98%）。

1.3 菌株

國際標準株Hp26695購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），由貴陽醫(yī)學(xué)院臨床檢驗教研室保存。Hp臨床分離株均分離自貴陽某醫(yī)院60例消化內(nèi)科患者胃黏膜標本。該60例患者因胃部不適行胃鏡檢查，標本取自胃竇部或胃體部黏膜，并經(jīng)尿素碳（14C）呼氣試驗陽性鑒定后，進行Hp的分離培養(yǎng)所得。

2 方法

2.1 分離培養(yǎng)

取胃黏膜標本，接種于哥倫比亞血瓊脂平板，37℃微需氧袋培養(yǎng)72～96 h后，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢和過氧化氫酶、氧化酶、尿素碳（14C）呼氣試驗均陽性鑒定為Hp后，進行增菌及傳代培養(yǎng)，－80℃保存。

2.2 藥敏試驗

采用E-test法檢測Hp對甲硝唑的最低抑菌濃度（M IC）。將細菌制備成1×108cfu·m L－1濃度的菌液，均勻涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上，貼上甲硝唑藥敏試紙條，37℃微需氧培養(yǎng)72 h。以M IC≥8 μg·m L－1判定為甲硝唑耐藥，M IC≥32 μg·m L－1判定為高水平甲硝唑耐藥，試驗重復(fù)3次[4]。

2.3 Hp基因組DNA提取

按DNA提取試劑盒說明提取Hp基因組總DNA。用紫外分光光度計對提取的DNA純度進行測定，計算260 nm和280 nm波長處的光密度比值（OD260nm/OD280nm），當比值≈1.8時，即認為DNA純度較高[5]。

2.4 PCR擴增

根據(jù)文獻[6]提供的引物序列合成特異性的引物，rdxA和cagA基因引物序列具體見表1。

表1 rdxA和cagA基因引物序列Tab 1 Primersof rdxA geneand cagA gene

采用PCR擴增，反應(yīng)體系為50μL，包括超純水19μL，上、下游引物各2μL，模板DNA 2μL，擴增酶Primix Taq 25μL。cagA擴增條件：94℃預(yù)變性5m in，之后變性30 s，51～52℃褪火，72℃延伸2min，最終延伸10min。rdxA擴增條件：94℃預(yù)變性5m in，之后變性30 s，53.7℃褪火，72℃延伸2m in，最終延伸10m in。每次擴增時均設(shè)標準株Hp26695作為陽性對照，未加模板的PCR擴增作為陰性對照。反應(yīng)完畢后取PCR產(chǎn)物2μL，置于1.0%瓊脂糖凝膠孔中電泳檢測PCR產(chǎn)物。

2.5 產(chǎn)物序列分析

將“2.4”項下得到的PCR產(chǎn)物送至北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。測序結(jié)果用BLAST軟件進行堿基序列分析。

3 結(jié)果

3.1 Hp的培養(yǎng)與藥敏結(jié)果

從60例患者胃黏膜標本中共分離出Hp臨床分離株11株。采用E-test法測定該11株Hp臨床菌對甲硝唑的M IC均≥256 μg·m L－1，表明其均為甲硝唑高耐藥株。

3.2 DNA提取結(jié)果

11株Hp臨床分離株與標準株Hp26695的DNA純度經(jīng)紫外分光光度計檢測，OD260nm/OD280nm均在1.75～1.8之間，表明其DNA純度均較高。

3.3 PCR擴增結(jié)果

11株臨床分離株和標準株Hp26695的rdxA和cagA基因均分別在750 bp和260 bp位置出現(xiàn)特異性條帶，rdxA和cagA基因的擴增率均為100%，具體擴增電泳圖見圖1、圖2（圖中，陰：陰性對照，陽：標準株Hp26695，M：marker）。

圖1 Hp臨床分離株的rdxA擴增電泳圖Fig 1 Am p lified electrophorogram of rdxA gene of clinical isolated Hp

圖2 Hp臨床分離株的cagA擴增電泳圖Fig 2 Am plified electrophorogram of cagA gene of Hp clinical isolated HP

3.4 產(chǎn)物測序結(jié)果

11株Hp臨床分離株與標準株Hp26695相應(yīng)基因序列比對后發(fā)現(xiàn)：11株Hp臨床分離株均含有rdxA和cagA基因，其核苷酸同源性分別為95%～98%、86%～94%，2基因分別有4、10個規(guī)律性突變。11株臨床分離株rdxA和cagA基因的相同突變位點和突變形式見表2。

表2 11株Hp臨床分離株rdxA和cagA基因的相同突變位點和突變形式Tab 2 Samemutations sites and form of rdxA gene and cagA gene in 11 strainsof clinical isolated Hp

4 討論

甲硝唑是硝基咪唑類藥物，有較強的抗Hp活性，是三聯(lián)方案中最廣泛應(yīng)用的抗菌藥物之一。隨著抗菌藥物的廣泛使用，Hp對甲硝唑的耐藥率呈逐年上升趨勢，是導(dǎo)致含甲硝唑方案治療Hp感染失敗的主要原因。本試驗從60例患者胃黏膜標本分離出11株Hp，其cagA基因全部為陽性，并且對甲硝唑的M IC均≥256μg·m L－1，表明全部為甲硝唑高耐藥株。

甲硝唑耐藥與rdxA基因有較為密切的關(guān)系。rdxA基因的插入、缺失導(dǎo)致下游翻譯終止密碼子的提前產(chǎn)生，rdxA蛋白合成提前終止；而堿基轉(zhuǎn)換、顛換突變直接導(dǎo)致氨基酸替換，這些突變均有可能導(dǎo)致rdxA蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，致使rdxA蛋白活性下降或失活而產(chǎn)生甲硝唑耐藥[7]。本研究中11株Hp臨床分離株均發(fā)生插入、缺失和堿基轉(zhuǎn)換3種突變類型，以堿基轉(zhuǎn)換為突變的主要類型，只出現(xiàn)單個堿基插入或缺失，未發(fā)現(xiàn)大片段序列插入或缺失，即均表現(xiàn)為點突變。本試驗發(fā)現(xiàn)rdxA基因變異位點大多不固定，但11株臨床分離株存在4個固定的突變位點，即均發(fā)生了1013598位點A→G、1013619位點G→A、1013961位點C→T、1014149位點A→G。這些位點的改變均未見文獻報道，筆者推測這些位點的突變與甲硝唑的耐藥可能有密切的關(guān)系，實際情況有待于增加臨床菌株數(shù)后再進一步的證實。

Hp菌株的基因型不同是導(dǎo)致感染后臨床結(jié)果不同的重要因素之一。cagA基因是Hp重要的毒力因子，可以作為評價Hp毒力的指標。研究[8]表明，Hp菌株中約有45%以上含有cagA基因，cagA陽性患者的消化道潰瘍和胃癌的發(fā)生率明顯升高，并且cagA陽性與疾病嚴重程度呈正相關(guān)。本試驗11株Hp臨床分離株均擴增出cagA基因，其與標準株Hp26695相應(yīng)基因序列相比同源性低于94%，序列間存在堿基的插入、缺失和替換。這可能與cagA基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)都存在多樣性有關(guān)。謝國艷等[6]報道Hp高耐藥菌中cagA陽性菌株的rdxA基因突變率明顯高于cagA陰性菌株，并推測cagA陽性Hp菌株的rdxA基因突變與甲硝唑產(chǎn)生高水平耐藥可能有一定關(guān)系。該報道和本研究結(jié)果有相似之處。

研究Hp對甲硝唑的耐藥機制為個體化用藥以及為選擇合適的抗菌藥物用于臨床治療奠定了基礎(chǔ)。本研究提示，Hp對甲硝唑耐藥性不僅可能與rdxA基因突變有關(guān)，亦可能與cagA基因相關(guān)。在后續(xù)的研究中，筆者將增加樣本量，運用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法對其進行驗證。

[1]Cover TL，BlaserMJ.Helicobacterpylori in health and disease[J].Gastroenterology，2009，136（6）：1 863.

[2]Jenks PJ，Edwards DI.Metronidazole resistance in helicobacterpylori[J].Int JAntimicrob Agents，2002，19（1）：1.

[3]Goodw in A，Kersulyte A，Sisson G，et al.Metronidazole resistance in helicobacter pylori is due to nullmutations in a gene（rdxA）thatencodes an oxygen-insensitive NADPH nitroreductase[J].MolMicrobiol，1998，28（2）：383．

[4]Jeong JY，Mukhopadhyay AK，Dailidiene D，etal.Sequential inactivation of rdxA（Hp0954）and frxA（Hp0642）nitroreductase genes causesmoderate and high-levelmetronidazole resistance in helicobacter pylori[J].Journal of Bacteriology，2000，182（18）：5 082.

[5]徐克前.分子生物學(xué)檢驗技術(shù)實驗指導(dǎo)[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：22.

[6]謝國艷，高志生，胡嘉波，等.耐甲硝唑幽門螺桿菌cagA基因檢測與rdxA基因突變研究[J].臨床檢驗雜志，2010，28（3）：204.

[7]Matteo MJ，Pérez CV，Dom ingo MR，etal.DNA sequence analysis of rdxA and frxA from paired metronidazolesensitive and resistant helicobacter pylori isolates obtained from patientsw ith heteroresistance[J].Int JAntimicrob Agents，2006，27（2）：152.

[8]LadeiraMS，Bueno RC，Dos-Santos BF，etal.Relationship among oxidative DNA damage，gastricmucosal density and the relevance of cagA，vacA and iceA genotypesof helicobacterpylori[J].Dig Dis Sci，2008，53（2）：248.