劉雪麗，孫勇，徐麗灑，安珂瑤（.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，山東青島26602；2.青島市中心醫(yī)院藥劑科，山東青島 266042）

鹽酸西替利嗪（Cetirizine Hydrochloride），是第2代H1受體拮抗藥，可抑制嗜酸粒細(xì)胞游走[1]，抑制變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的多種炎癥介質(zhì)的釋放，能與人H1受體選擇性高親和力結(jié)合[2]，同時還具有較廣泛的抗炎作用。有研究[3]證實，H1受體存在于真皮成纖維細(xì)胞上，鹽酸西替利嗪可通過阻滯真皮成纖維細(xì)胞上的H1受體抑制中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化而發(fā)揮抗皮膚過敏作用。藥動學(xué)研究[4]表明，鹽酸西替利嗪具有口服吸收快、起效快、作用持久的優(yōu)點(diǎn)；臨床研究[5，6]表明，其用于治療蕁麻疹和季節(jié)性過敏性鼻炎優(yōu)于常用的第2代抗組胺類藥物。目前上市的鹽酸西替利嗪制劑多為片劑，口服后有嗜睡等中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)；且其通過肝臟細(xì)胞色素P450酶代謝，能使肝酶升高，膽紅素增加，產(chǎn)生肝臟損害，刺激食欲，引起體重增加，產(chǎn)生腎毒性；此外還可以引起皮疹和心臟毒性等[7]。為了減少藥物的首關(guān)效應(yīng)以及口服過程中出現(xiàn)的不良反應(yīng)，筆者在實驗中制備油包水型鹽酸西替利嗪搽劑外用于皮膚，用于治療各種過敏性皮膚反應(yīng)、蚊蟲叮咬等。本研究以鹽酸羥嗪為內(nèi)標(biāo)，建立了高效液相色譜（HPLC）法測定大鼠背部皮膚外用鹽酸西替利嗪后皮膚組織中鹽酸西替利嗪含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-10Atvp HPLC儀，包括輸液泵、LC-10AD紫外檢測器、CTO-10Asvp柱溫箱、Lab Solutions色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）；BS124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；PM180R型高速冷凍離心機(jī)（上海易擴(kuò)儀器有限公司）；FSH-2型可調(diào)高速勻漿機(jī)（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸西替利嗪標(biāo)準(zhǔn)品（批號：100659-200401，純度：100%）、鹽酸羥嗪標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)，批號：100266-200201，純度：98.6%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；鹽酸西替利嗪搽劑（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院自制，批號：2010101601，含量：10 g·L－1）；乙腈為色譜純，乙酸乙酯和二氯甲烷均為分析純，水為純化水。

1.3 動物

Wistar大鼠，♂，體重180～220 g，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供，許可證號：SCXK（鄂）2004-0007。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱取鹽酸西替利嗪標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，置于100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成濃度200 mg·L－1的貯備液；再以水按比例稀釋貯備液，制備成0.8、2、10、50、100、120 mg·L－1系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于4℃冰箱內(nèi)保存待用。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液。精密稱取純度為98.6%的鹽酸羥嗪標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于1 000 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成濃度9.86 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液，置于4℃冰箱內(nèi)保存待用。

2.1.3 枸櫞酸緩沖液。制備2.1%枸櫞酸水溶液，用50%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.5，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），預(yù)柱：Eclipse XDB-C18保護(hù)柱（12.5 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.05 mol·L－1磷酸二氫銨水溶液（330∶700，V/V），流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：229 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30℃。

2.3 皮膚組織樣品預(yù)處理

取大鼠皮膚組織勻漿200 μL，置于10 mL離心管中，分別加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液和200 μL枸櫞酸緩沖液，混勻，加乙酸乙酯-二氯甲烷（30∶1，V/V）萃取液萃取2次，每次1.5 mL，渦旋混勻1 min，3 500 r·min－1離心10 min，合并萃取上清液置于另一試管中，以高純氮?dú)庥?0℃水浴上吹干，殘留物加枸櫞酸緩沖液200 μL復(fù)溶后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，10 000 r·min－1離心3 min，吸取20 μL上清液進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性考察

取6只正常大鼠空白皮膚組織勻漿200 μL，加入50 μL水代替內(nèi)標(biāo)，作為空白皮膚組織溶液；取上述空白皮膚組織勻漿200 μL，加50 mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液制成含鹽酸西替利嗪15.0 μg·mL－1和鹽酸羥嗪3.94 μg·mL－1的皮膚組織勻漿，作為空白皮膚組織+標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)溶液；另取6只大鼠給藥后皮膚組織樣品勻漿，作為皮膚組織樣品溶液。均依法預(yù)處理后，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜。結(jié)果表明，鹽酸西替利嗪和鹽酸羥嗪在此色譜條件下保留時間分別為14.3 min和12.2 min，空白皮膚組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾鹽酸西替利嗪和鹽酸羥嗪的測定。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白皮膚組織；B.空白皮膚組織+標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)；C.皮膚組織樣品；1.鹽酸西替利嗪；2.鹽酸羥嗪Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank skin tissue；B.blank skin tissue+standard+internal standard；C.skin tissue sample；1.cetirizine hydrochloride；2.hydroxyzine hydrochloride

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取大鼠空白皮膚組織勻漿，置于10 mL離心管中，加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻，制備成鹽酸西替利嗪濃度分別為0.80、4.0、20.0、40.0、48.0、96.0 μg·mL－1的組織樣品，預(yù)處理后進(jìn)樣20.0 μL，記錄色譜。以待測物濃度（X）為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。得回歸方程為Y＝0.076 65X+0.000 72（r＝0.999 2），結(jié)果表明，鹽酸西替利嗪檢測濃度的線性范圍為0.80～96.0 μg·mL－1。

2.6 定量下限考察

取大鼠空白皮膚組織勻漿，置于10 mL離心管中，加入濃度為0.800 mg·L－1的對照品溶液制備成鹽酸西替利嗪濃度為0.320 μg·mL－1的組織樣品，預(yù)處理后進(jìn)樣20 μL，重復(fù)5次，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。結(jié)果表明，鹽酸西替利嗪的定量下限為0.320 μg·mL－1。

2.7 精密度試驗

取大鼠空白皮膚組織勻漿，分別加入不同濃度的對照品溶液，制備成鹽酸西替利嗪濃度分別為0.800、4.00、40.0 μg·mL－1的組織樣品，每種濃度5份，預(yù)處理后進(jìn)樣20 μL，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，連續(xù)測定3 d，求得方法的精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD均小于6.9%，日間RSD均小于8.1%。

2.8 提取回收率試驗

取大鼠空白皮膚組織勻漿，分別加入不同濃度的對照品溶液，制備成低、中、高濃度（鹽酸西替利嗪濃度分別為0.800、4.00、40.0 μg·mL－1）的組織樣品，每種濃度5份，進(jìn)行預(yù)處理；同時另取空白皮膚組織勻漿200 μL，除不加對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外，按“2.3”項下預(yù)處理，進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)峰面積（3次測定的平均值），計算提取回收率，結(jié)果見表1。

表1 提取回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of extraction recovery test

2.9 穩(wěn)定性試驗

取大鼠空白皮膚組織勻漿，分別加入不同濃度的對照品溶液，制備成低、高濃度（鹽酸西替利嗪濃度分別為0.800、40.0 μg·mL－1）的皮膚組織樣品，每種濃度3份，分別按如下處理考察穩(wěn)定性：（1）于室溫放置0、5 h后預(yù)處理，進(jìn)樣測定；（2）預(yù)處理后再放置12 h后測定；（3）于－20℃下冷凍24 h以上，然后在室溫自然解凍，反復(fù)凍融3次，預(yù)處理后進(jìn)樣測定；（4）于－20℃保存4、14 d后取出，室溫自然解凍，預(yù)處理后進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，鹽酸西替利嗪皮膚組織樣品含量的RSD均在2.3%～9.7%，表明其穩(wěn)定性較好。

2.10 樣品測定

取大鼠6只，晚間禁食不禁水12 h以上，早晨稱量空腹體重，根據(jù)空腹體重給藥，給藥量為20.0 mg·kg－1。將鹽酸西替利嗪搽劑均勻地擦拭在3 cm×3 cm用電動剃毛器剃過毛的大鼠正常皮膚背部。給藥后4 h脫頸椎處死大鼠，在其脫毛部位立即用600 mL水清洗皮膚，濾紙將水吸干后，用剪刀剪取背部皮膚大約0.500 g，剪碎稱重后加4倍量的水，10 000 r·min－1勻漿10 min，制成25.0%的組織勻漿，預(yù)處理后進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，大鼠皮膚組織中鹽酸西替利嗪的平均含量為（81.7±2.44）μg·g－1。

3 討論

本試驗取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和皮膚組織樣品溶液在210～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定了檢測波長為229 nm，與2010年版《中國藥典》一致。

鹽酸羥嗪在本色譜條件下的保留時間與鹽酸西替利嗪接近，以其為內(nèi)標(biāo)，可有效消除操作誤差，以提高測定準(zhǔn)確性。

據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)[8]，成人每日1次口服西替利嗪片10 mg，其達(dá)峰濃度為300 ng·mL－1，本實驗大鼠鹽酸西替利嗪搽劑的給藥量為20.0 mg·kg－1；測得大鼠皮膚組織中鹽酸西替利嗪的平均含量為（81.7±2.44）μg·g－1，可以在局部達(dá)到有效治療量。結(jié)果表明，鹽酸西替利嗪搽劑避免了首關(guān)效應(yīng)及對大鼠胃腸的刺激，提高了臨床用藥的安全性。

筆者曾選用60%甲醇、乙腈、乙酸乙酯萃取皮膚組織中的鹽酸西替利嗪，結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取的效率最高。

綜上所述，本方法操作簡單、準(zhǔn)確、靈敏，可用于大鼠皮膚組織中鹽酸西替利嗪的含量測定，為西替利嗪外用制劑的研發(fā)提供了參考。

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[2]Gillard M，van Der Perren C，Massingham R，et al.Binding characteristics of[3H]levocetirizine to cloned human H1histamine-receptors expressed in CHO cells[J].Inflamm Res，2002，51（Suppl 1）：77.

[3]宋洪杰，胡晉紅，黃 瑾，等.西替利嗪干預(yù)組胺誘導(dǎo)的真皮成纖維細(xì)胞IL-8和MCP-1產(chǎn)生[J].中國藥理學(xué)通報，2005，21（4）：457.

[4]Benedetti MS，Plisnier M，Kaise J，et al.Absorption，distribution，metabolism and excretion of[14C]levocetirizine，the R enantiomer of cetirizine，in healthy volunteers[J].Eur J Clin Pharmacol，2001，57（8）：571.

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[6]徐學(xué)君.國外臨床應(yīng)用西替利嗪的概況[J].中國藥師，1999，2（5）：238.

[7]李建成，關(guān)艷娟，韓培紅.抗組胺藥及其不良反應(yīng)[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18（9）：1 068.

[8]鐘 玲，任先達(dá).西替利嗪的安全性指標(biāo)測定[J].暨南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版），2001，22（6）：18.