譚 蓓 戴張晗 呂 紅 王 鷗 楊 紅 錢家鳴#

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科1(100730)內(nèi)分泌科 衛(wèi)生部?jī)?nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

目前認(rèn)為炎癥性腸病(IBD)是以遺傳易感性為基礎(chǔ)，環(huán)境因素參與，黏膜免疫系統(tǒng)對(duì)腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)(如共生菌)的異常免疫應(yīng)答而造成的腸道損傷。近年研究發(fā)現(xiàn)，除具有調(diào)節(jié)鈣、磷代謝的傳統(tǒng)作用外，維生素D(VitD)還具有抗感染和調(diào)節(jié)免疫的作用［1］。IBD患者普遍存在VitD缺乏，且與病情程度相關(guān)［2］，目前兩者的關(guān)系日漸受到關(guān)注。本研究采用三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型，通過(guò)給予不同劑量VitD3干預(yù)，旨在探討VitD3對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效及其作用機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠66只，4～8周齡，體質(zhì)量0.20～0.25 kg，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，于北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

TNBS、活性 VitD31，25(OH)2D3購(gòu)自 Sigma 公司;5-氨基水楊酸(5-ASA)為德國(guó)Dr.Falk Pharma GmbH生產(chǎn)的美沙拉嗪灌腸液;VitD3(商品名:英康利)購(gòu)自上海信誼金朱藥業(yè)有限公司。髓過(guò)氧化物酶(MPO)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq PCR MasterMix均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

二、研究方法

1.結(jié)腸炎模型的建立和藥物干預(yù):將大鼠隨機(jī)分為11組，每組各6只。根據(jù)Morris等［3］的方法，將TNBS 100 mg/kg溶于50%乙醇溶液0.25 mL后灌腸各組大鼠(除外空白對(duì)照組)，以制備結(jié)腸炎模型。造模24 h后開(kāi)始藥物干預(yù)，具體方法見(jiàn)表1。造模第10 d處死大鼠，心臟取血和采集結(jié)腸組織。

2.結(jié)腸炎病情評(píng)估:每日觀察大鼠體質(zhì)量變化、大便性狀和隱血等情況，行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分［4］。取距肛門3 cm至回盲部的結(jié)腸，行大體損傷評(píng)分［5］。取距肛門4～5 cm結(jié)腸組織，4%甲醛固定，行HE染色，評(píng)估組織病理學(xué)評(píng)分［6］。取距肛門3～4 cm結(jié)腸組織，以0.9%NaCl溶液混合后勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)MPO活性。

3.RT-PCR 檢測(cè)T-bet、GATA-3 mRNA 表達(dá):取距肛門5 cm起的結(jié)腸組織約20 mg，提取結(jié)腸組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，行PCR擴(kuò)增。各目的基因引物序列［7］見(jiàn)表2，均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25μL，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，各自退火溫度退火30 s，72℃延伸1 min，共45個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Quantity One軟件分析各條帶平均灰度值，比較目的條帶與內(nèi)參照條帶比值，行半定量分析。

表1 各組大鼠藥物干預(yù)情況

表2 目的基因引物序列、擴(kuò)增片段和退火溫度

4.不良反應(yīng)監(jiān)測(cè):心臟取血5 mL，離心分離血清，采用日本Olympus AU-5400全自動(dòng)生化儀測(cè)定鈣和肌酐水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以ˉx±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，若存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步兩兩比較應(yīng)用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、結(jié)腸炎模型

造模后大鼠均出現(xiàn)腹瀉、血便、體質(zhì)量減輕等癥狀;可見(jiàn)腸壁增厚、充血糜爛、活動(dòng)期潰瘍，甚至腸腔狹窄、透壁性潰瘍、與周圍組織黏連等;結(jié)腸上皮層局部黏膜缺失，固有層腺體破壞，黏膜下層大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1)。與空白對(duì)照組相比，TNBS組DAI評(píng)分、大體損傷評(píng)分、組織病理學(xué)評(píng)分和MPO活性均明顯升高(P＜0.001)(見(jiàn)表3)。

表3 各組大鼠DAI、大體損傷和組織病理學(xué)評(píng)分、MPO活性以及T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)±s)

表3 各組大鼠DAI、大體損傷和組織病理學(xué)評(píng)分、MPO活性以及T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)±s)

*與空白對(duì)照組比較，P＜0.001;#與TNBS組比較，P＜0.05;▲與5-ASA組比較，P＜0.05

組 別 例數(shù) DAI評(píng)分 大體損傷評(píng)分GATA-3 0 0.02±0.02 0 0.38±0.15 TNBS組 6 3.40±0.56* 7.83±2.04* 4.00±0.71* 0.52±0.09* 0.07±0.18 0.37±0.14 5-ASA組 6 3.00±0.77 5.67±1.63 2.58±0.49# 0.15±0.06# 0 0.55±0.15#常規(guī)劑量VitD3組 6 2.82±1.52 7.33±1.75 3.08±1.11 0.13±0.03# 0.05±0.06 0.38±0.11常規(guī)劑量VitD3+5-ASA組 6 2.38±1.42 6.50±4.28 2.83±1.60 0.12±0.04# 0.08±0.12 0.38±0.19單次大劑量VitD3組 6 2.43±1.23 6.67±1.63 3.42±0.97 0.10±0.03# 0 0.46±0.18單次大劑量VitD3+5-ASA組 6 2.00±0.91 3.40±2.88# 2.10±1.02# 0.11±0.01# 0 0.22±0.06連續(xù)大劑量VitD3組 6 2.98±1.28 7.00±2.00 3.42±0.86 0.24±0.12# 0 0.56±0.12#連續(xù)大劑量VitD3+5-ASA組 6 2.33±2.00 3.17±3.19# 1.00±1.38#▲ 0.12±0.05# 0 0.48±0.14活性VitD3組 6 2.35±0.97 6.17±3.43 2.92±1.24 0.26±0.13# 0.05±0.08 0.32±0.17活性VitD3+5-ASA組 6 3.27±1.09 6.83±3.19 3.17±1.37 0.21±0.14#mRNA空白對(duì)照組組織病理學(xué)評(píng)分MPO活性(U/g組織)T-bet mRNA 6 0 0 0.03±0.07 0.43±0.21

二、藥物干預(yù)對(duì)結(jié)腸炎的影響

各藥物干預(yù)組結(jié)腸壁充血、潰瘍、狹窄、黏連以及結(jié)腸上皮黏膜缺失、細(xì)胞浸潤(rùn)等情況均較TNBS組有所減輕(見(jiàn)圖1)。與TNBS組相比，各藥物干預(yù)組DAI評(píng)分雖下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);單次大劑量VitD3+5-ASA組、連續(xù)大劑量VitD3+5-ASA組大體損傷評(píng)分明顯下降(P=0.007和P=0.003);5-ASA組、單次大劑量VitD3+5-ASA組和連續(xù)大劑量VitD3+5-ASA組組織病理學(xué)評(píng)分明顯下降(P=0.026、P=0.005和P＜0.001);各藥物干預(yù)組MPO活性均明顯下降(P＜0.001)。聯(lián)合5-ASA后，各組DAI、大體損傷評(píng)分、組織病理學(xué)評(píng)分和MPO活性與5-ASA組相比均無(wú)明顯差異(P＞0.05)，連續(xù)大劑量VitD3+5-ASA組組織病理學(xué)評(píng)分較5-ASA組明顯下降(P=0.013)(見(jiàn)表3)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理(HE染色 ×100)

三、T-bet、GATA-3 mRNA 表達(dá)

1.T-bet mRNA表達(dá):T-bet在空白對(duì)照組無(wú)表達(dá)，TNBS組表達(dá)較弱，兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.101)。各藥物干預(yù)組T-bet mRNA表達(dá)與TNBS組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其中5-ASA組、單次大劑量VitD3組、單次大劑量VitD3+5-ASA組、連續(xù)大劑量VitD3組、連續(xù)大劑量VitD3+5-ASA組表達(dá)均缺失(見(jiàn)表3、圖2)。

2.GATA-3 mRNA表達(dá):與空白對(duì)照組相比，TNBS組GATA-3 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P=0.838)。與TNBS組相比，5-ASA組(P=0.037)、連續(xù)大劑量VitD3組(P=0.035)表達(dá)明顯升高，其余藥物干預(yù)組無(wú)明顯差異(見(jiàn)表3、圖2)。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)的電泳圖

四、不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)

連續(xù)大劑量 VitD3組、連續(xù)大劑量 VitD3+5-ASA組大鼠出現(xiàn)高鈣血癥，血鈣水平明顯高于其余各組(P＜0.05)。所有組別大鼠肌酐水平均在正常范圍內(nèi)［8］，但連續(xù)大劑量 VitD3組血肌酐水平明顯高于其余各組(P＜0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 各組大鼠血鈣和血肌酐水平±s)

表4 各組大鼠血鈣和血肌酐水平±s)

?與連續(xù)大劑量VitD3組比較，P＜0.05;※與連續(xù)大劑量 VitD3+5-ASA組比較，P＜0.05

組 別 例數(shù) 血鈣(mmol/L)血肌酐(μmol/L)空白對(duì)照組 6 2.58±0.95?※ 22.60±2.07?TNBS組 6 2.59±0.12?※ 20.00±6.92?5-ASA 組 6 2.63±0.08?※ 21.72±3.24?常規(guī)劑量 VitD3組 6 2.48 ±0.17?※ 18.77±2.89?常規(guī)劑量VitD3+5-ASA組 6 2.40±0.16?※ 21.55±7.84?單次大劑量VitD3組 6 2.66±0.12?※ 19.28±3.26?單次大劑量VitD3+5-ASA組 6 2.44±0.05?※ 17.70±1.67?連續(xù)大劑量VitD3組 6 3.36±0.30 28.82±10.61連續(xù)大劑量VitD3+5-ASA組 6 3.15±0.30 21.95±7.05?活性 VitD3組 6 2.62 ±0.15?※ 22.18±3.42?活性VitD3+5-ASA組 6 2.61±0.23?※ 21.93±4.64?

討 論

1989年Morris等［3］首次提出以TNBS法制備大鼠結(jié)腸炎模型，TNBS是一種半抗原物質(zhì)，在乙醇破壞腸黏膜屏障后，與腸黏膜角蛋白結(jié)合成為全抗原，激發(fā)局部免疫反應(yīng)，造成與人類IBD相似的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。MPO是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中的酶之一，與急性炎癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究以TNBS誘導(dǎo)后大鼠均出現(xiàn)腹瀉、血便、體質(zhì)量下降，結(jié)腸壁增厚、充血糜爛和潰瘍，并伴有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，大體損傷評(píng)分和組織病理學(xué)評(píng)分、MPO活性均明顯升高，表明TNBS成功誘導(dǎo)了實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。

目前VitD3的推薦劑量主要針對(duì)普通人群預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松，尚缺乏VitD3對(duì)IBD患者起免疫調(diào)節(jié)作用所需劑量的相關(guān)數(shù)據(jù)。因此，本研究采用常規(guī)劑量、單次大劑量和連續(xù)大劑量VitD3三種不同劑量梯度以觀察大鼠炎癥改善情況。結(jié)果顯示不同劑量VitD3干預(yù)組MPO活性均較TNBS組明顯下降，表明VitD3可減輕腸道中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的急性炎癥。其中單次或連續(xù)大劑量VitD3聯(lián)合5-ASA的療效較常規(guī)劑量VitD3更為突出，表現(xiàn)為大體損傷和組織病理學(xué)評(píng)分較TNBS組明顯減輕，而常規(guī)劑量VitD3組與TNBS無(wú)明顯差異。然而隨著VitD3劑量增加，不良反應(yīng)亦增多，連續(xù)大劑量VitD3導(dǎo)致血鈣和血肌酐水平均明顯升高。目前有研究［9，10］應(yīng)用VitD3類似物治療IBD，均取得良好的療效，為將來(lái)增加VitD3治療劑量提供了一定依據(jù)。

傳統(tǒng)上將CD4+T細(xì)胞分為Th1和Th2細(xì)胞，其分化受轉(zhuǎn)錄因子影響。T-bet是Th1型免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［11］，GATA-3是一種鋅指蛋白，為Th2的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［12］。Th1/Th2細(xì)胞比例失衡在IBD發(fā)病中起重要作用。TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎以Th1為主，類似于人類克羅恩病(CD)，抑制T-bet表達(dá)而上調(diào)GATA-3表達(dá)可影響T細(xì)胞從Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞的分化。有研究發(fā)現(xiàn)VitD3具有免疫調(diào)節(jié)作用，Daniel等［13］發(fā)現(xiàn)活性 VitD3和活性 VitD3+地塞米松組中GATA-3表達(dá)分別是TNBS實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的2倍和5倍，且活性VitD3聯(lián)合地塞米松較單用地塞米松可明顯下調(diào)T-bet。本研究中，空白對(duì)照組不表達(dá)T-bet，TNBS組弱表達(dá)，符合TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎以Th1為主，單次或連續(xù)大劑量VitD3聯(lián)合5-ASA均可使 T-bet表達(dá)缺失，同時(shí)5-ASA、連續(xù)大劑量VitD3可上調(diào) GATA-3表達(dá)，因此考慮VitD3可能通過(guò)Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫。

本研究中，活性VitD3組補(bǔ)充的1，25(OH)2D3僅為常規(guī)劑量，其對(duì)大鼠大體、組織學(xué)和T細(xì)胞免疫均未表現(xiàn)出明顯的治療作用。因而，考慮VitD3所表現(xiàn)出的減輕炎癥作用與劑量而非劑型相關(guān)，活性VitD3價(jià)格相對(duì)昂貴，臨床上可選擇普通VitD3并適當(dāng)增加補(bǔ)充劑量。

本研究中，應(yīng)用5-ASA雖在T細(xì)胞免疫和組織學(xué)評(píng)估中表現(xiàn)出一定治療效果，但并未能使大體損傷較TNBS組明顯減輕，與臨床上5-ASA治療CD的效果相一致。而5-ASA聯(lián)合大劑量VitD3后，大鼠結(jié)腸炎組織病理學(xué)進(jìn)一步減輕，提示在IBD臨床治療中輔以中-高劑量VitD3或許能提高傳統(tǒng)藥物的治療效果，起較好的協(xié)同作用。

此外，本研究中TNBS組大體損傷和組織病理學(xué)評(píng)分均明顯高于空白對(duì)照組，但T-bet和GATA-3 mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異，原因可能為大鼠于造模后第10 d處死時(shí)，其實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎已趨于慢性化且存在自愈趨勢(shì)，故炎性因子水平已有所下降，但組織學(xué)修復(fù)需一定過(guò)程，故遲于炎性因子變化。

綜上所述，VitD3可減輕TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎急性炎癥，單次和連續(xù)大劑量VitD3聯(lián)合5-ASA可進(jìn)一步明顯減輕大體損傷和組織病理學(xué)炎癥，單次或連續(xù)大劑量VitD3及其聯(lián)合5-ASA可下調(diào)T-bet表達(dá)，5-ASA和連續(xù)大劑量 VitD3上調(diào) GATA-3表達(dá)，但VitD3劑量過(guò)大會(huì)引發(fā)高鈣血癥和肌酐升高。說(shuō)明VitD3可通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫減輕TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)，并控制不良反應(yīng)的發(fā)生。

1 Raftery T，O’Morain C，O’Sullivan M.Vitamin D:New roles and therapeutic potential in inflammatory bowel disease［J］.Curr Drug Metab，2012 ［Epub ahead of print］.

2 Leslie WD，Miller N，Rogala L，et al.Vitamin D status and bone density in recently diagnosed inflammatory bowel disease:the Manitoba IBD Cohort Study［J］.Am J Gastroenterol，2008，103(6):1451-1459.

3 Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon［J］.Gastroenterology，1989，96(3):795-803.

4 Murano M，Maemura K，Hirata I，et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B(p65)antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis［J］.Clin Exp Immunol，2000，120(1):51-58.

5 Wallace JL，Keenan CM.An orally active inhibitor of leukotriene synthesis accelerates healing in a rat model of colitis［J］.Am J Physiol，1990，258(4 Pt 1):G527-G534.

6 Sykes AP，Bhogal R，Brampton C，et al.The effect of an inhibitor of matrix metalloproteinases on colonic inflammation in a trinitrobenzenesulphonic acid rat model of inflammatory bowel disease［J］.Aliment Pharmacol Ther，1999，13(11):1535-1542.

7 陳冬，李玉曉，李添應(yīng)，等.大蒜新素對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3表達(dá)的影響［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，45(2):133-138.

8 林健，鄭麗紅，陳潤(rùn)，等.SD大鼠血液生化指標(biāo)正常參考值范圍的探討［J］.醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2005，21(5):321-322.

9 Daniel C，Radeke HH，Sartory NA，et al.The new low calcemic vitamin D analog 22-ene-25-oxa-vitamin D prominently ameliorates T helper cell type 1-mediated colitis in mice［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，319(2):622-631.

10 Stio M，Martinesi M，Bruni S，et al.Interaction among vitamin D(3)analogue KH 1060，TNF-alpha，and vitamin D receptor protein in peripheral blood mononuclear cells of inflammatory bowel disease patients［J］.Int Immunopharmacol，2006，6(7):1083-1092.

11 Peng SL.The T-box transcription factor T-bet in immunity and autoimmunity［J］.Cell Mol Immunol，2006，3(2):87-95.

12 Ray A，Cohn L.Th2 cells and GATA-3 in asthma:new insights into the regulation of airway inflammation［J］.J Clin Invest，1999，104(8):985-993.

13 Daniel C，Sartory NA，Zahn N，et al.Immune modulatory treatment of trinitrobenzene sulfonic acid colitis with calcitriol is associated with a change of a T helper(Th)1/Th17 to a Th2 and regulatory T cell profile［J］.J Pharmacol Exp Ther，2008，324(1):23-33.