陸 航 劉學(xué)政 孫巨峰 (廣西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，廣西 南寧 53002)

胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是其高死亡率的主要原因。研究表明，人CXC型趨化因子配體及受體(CXCL12/CXCR4)基因在胃癌細(xì)胞中大量表達(dá)〔1，2〕，說明CXCL12/CXCR4軸在胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性的作用。目前，RNA干擾技術(shù)以其高效率及高特異性抑制基因的表達(dá)，已成為癌癥治療研究的突破點。本實驗成功將重組腺病毒載體CXCR4－shRNA轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系SGC7901，檢測抑制CXCR4基因的表達(dá)對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖及侵襲力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SCG7901和CXCR4－siRNA重組腺病毒載體由遼寧醫(yī)學(xué)院中心實驗室保存;胎牛血清(BSA)購自四季青生物工程材料有限公司;MTT購自Amresco公司;RT－PCR二步法試劑盒購自Fermentas公司;Transwell小室購自corning公司。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染SGC7901 本實驗小組前期已經(jīng)成功構(gòu)建重組腺病毒載體CXCR4－shRNA，并酶切測序鑒定成功。實驗分三組:空白組;對照組序列為:正義鏈5′－TGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAAGCGC GCTTTTTC－3′反義鏈 5′－TCGAGAAAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAAGCGCGCA－3′;實驗組序列為:正義鏈 5′－TCTATTCCCGACTTCATCTTTGCTCGAGCAAAGATGA AGTCGGGAATAGTTTTTC－3′，反 義 鏈 5′－TCGAGAAAAACTATTCCCGACTTCATCTTTGCTCGAGCAAAGATGAAGTCGGGAATAGA－3′。用含10%BSA的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)SGC7901，至細(xì)胞匯合至70%～80%時，以不引起明顯氯化聚乙烯(CPE)的最大感染復(fù)數(shù)(MOI)值進(jìn)行轉(zhuǎn)染，倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.2.2 RT－PCR測定轉(zhuǎn)染后CXCR4表達(dá)情況 以GenBank中CXCR4基因序列(NM_003467)為模板設(shè)計引物序列，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 564 bp，上游序列為 5′－GTTGGCTGAAAAGGTGGTCTAT－3′，下游序列為 5′－AGCAGGACAGGATGACAATACC－3′，內(nèi)參為β－肌動蛋白(β－actin)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染 72 h后，TRizol法提取總RNA。按照RT－PCR二步法試劑盒說明書進(jìn)行操作，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 MTT法測定細(xì)胞增殖 SGC7901處于對數(shù)生長期時制成細(xì)胞懸液，以密度為1×104/孔接種到96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入含shRNA－CXCR4腺病毒載體的培養(yǎng)液和空白培養(yǎng)液，于轉(zhuǎn)染后72 h加入5 mg/ml的MTT溶液每孔10 ml，溫箱孵育4 h后棄上清，每孔加入 DMSO 150 μl震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀測定490 nm波長的OD值，以無細(xì)胞的空白孔調(diào)零。反復(fù)三次取平均值。

1.2.4 Transwell小室細(xì)胞侵襲力測定 將50 mg/L的Matrigel膠的1∶8稀釋液置于Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。吸棄殘余液體，再用含10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)液水化基底膜。制備CXCR4－shRNA轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞，無血清培養(yǎng)12 h后制細(xì)胞懸液，調(diào)整密度至1×105個/L，將上室加入無血清的細(xì)胞懸液200 μl后，置于含10%BSA培養(yǎng)液500 μl的24孔板內(nèi)，分別常規(guī)培養(yǎng)48 h。用棉簽去除上室內(nèi)的細(xì)胞和基質(zhì)膠，上室底部采用0.1%結(jié)晶紫染色，33%醋酸脫色，倒置顯微鏡下觀察，每復(fù)孔隨機(jī)取6個視野計算細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況 胃癌細(xì)胞SGC7901正常培養(yǎng)匯合至80%(×100);腺病毒小片段轉(zhuǎn)染SGC790172 h后綠色熒光大量表達(dá)，無明顯CPE。見圖1。

2.2 RT－PCR檢測結(jié)果 空白組與對照組CXCR4 mRNA表達(dá)量明顯高于實驗組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而空白組與對照組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見圖2。

2.3 MTT檢測SC7901細(xì)胞增殖 空白組與對照組細(xì)胞生長迅速，兩組之間無顯著性差異(P＞0.05);實驗組經(jīng)腺病毒載體轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖程度顯著減少，與前兩組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見圖3。

2.4 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲力 shRNA－CXCR4腺病毒載體和空白組及對照組相比能顯著抑制SGC7901細(xì)胞的侵襲力(113.8±9.2 vs 264.7±15.7 vs 270.5±16.9)(P＜0.05)。空白組與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 CXCR4-shRNA腺病毒載體在SCG7901細(xì)胞中的表達(dá)(×100)

圖2 RT-PCR檢測CXCR4 mRNA表達(dá)

圖3 SGC7901細(xì)胞增殖生長曲線

3 討論

由于生存環(huán)境的變化、人口老齡化及生物學(xué)因素和遺傳學(xué)因素等多方面的影響，全球惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，而惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是其高復(fù)發(fā)和高死亡的主要原因。研究表明，胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程包括細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解、癌細(xì)胞黏附性的改變、局部侵襲、腫瘤血管生成、通過血管侵襲淋巴、免疫逃避和腫瘤在新的微環(huán)境的存活;同時，CXCR4在胃癌Ⅲ期和Ⅳ期具有大量表達(dá)，說明胃癌的高侵襲性與CXCR4基因的表達(dá)具有相關(guān)性〔3～6〕。因此CXCR4在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用，抑制CXCR4的表達(dá)可以成為控制胃癌轉(zhuǎn)移的突破點。

本實驗通過腺病毒載體shRNA－CXCR4轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系SGC7901，通過基因沉默機(jī)制抑制胃癌細(xì)胞中CXCR4基因的表達(dá)，進(jìn)而觀察胃癌細(xì)胞的侵襲力和細(xì)胞狀態(tài)的變化。通過倒置熒光顯微鏡觀察和RT－PCR結(jié)果可以表明成功將腺病毒載體轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞，并抑制CXCR4基因的表達(dá)。MTT檢測結(jié)果表明，空白組與對照組細(xì)胞增殖迅速，兩組之間無顯著性差異，實驗組經(jīng)腺病毒載體轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖程度顯著減少，與前兩組相比有顯著性差異，表明shRNA－CXCR4腺病毒載體具有抑制SGC7901細(xì)胞增殖的作用。Transwell小室侵襲實驗表明，重組腺病毒載體shRNA－CXCR4轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901導(dǎo)致細(xì)胞穿膜數(shù)量減少，相對對照組和空白組有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，對照組和空白組比較沒有明顯差別，說明重組腺病毒載體shRNA－CXCR4能夠抑制胃癌細(xì)胞SGC7901侵襲力。

綜上所述，通過抑制CXCR4基因的表達(dá)，腺病毒表達(dá)載體能在一定程度上抑制SGC7901的侵襲和增殖，某種程度上抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這也為體內(nèi)實驗提供了理論基礎(chǔ)。

1 Kucia M，Reca R，Miekus K，et al.Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms:pivotal role of the SDF－1－CXCR4 axis〔J〕.Stem Cells，2005;23(7):879－94.

2 Lee HJ，Kim SW，Kim HY，et al.Chemokine receptor CXCR4 expression，function，and clinical implications in gastric cancer〔J〕.Int J Oncol，2009;34(2):473－80.

3 Zhao BC，Wang ZJ，Mao WZ，et al.CXCR4/SDF－1 axis is involved in lymph node metastasis of gastric carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2011;17(9):2389－96.

4 Yasumoto K，Koizumi K，Kawashima A，et al.Role of the CXCL12/CXCR4 axis in peritoneal carcinomatosis of gastric cancer〔J〕.Cancer Res，2006;66(4):2181－7.

5 Kijima T，Maulik G，Ma PC，et al.Regulation of cellular proliferation，cytoskeletal function，and signal transduction through CXCR4 and c－Kit in small cell lung cancer cells〔J〕.Cancer Res，2002;62(4):6304－11.

6 Hashimoto I，Koizumi K，Tatematsu M，et al.Blocking on the CXCR4/mTOR signa ling pathway induces the anti－metastatic properties and autophagic cell death in peritoneal disseminated gastric cancer cells〔J〕.Eur J Cancer，2008;44(7):1022－9.