李儒貴 雷飛飛 李云靜 謝杏榕 任永生 譚華炳

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院感染性疾病科，湖北 十堰 442000)

高脂血癥是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的主要原因。硫化氫(H2S)是機(jī)體心血管功能調(diào)節(jié)的新型氣體信號(hào)分子〔1〕，一氧化氮(NO)也是氣體信號(hào)分子，參與脂肪肝的發(fā)病。活性氧(ROS)是發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷的基礎(chǔ)。超氧化物歧化酶(SOD)是體內(nèi)一種重要的自由基清除劑，能夠平衡機(jī)體的ROS，避免超氧陰離子自由基濃度過高時(shí)引起的不良反應(yīng)。脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)可形成蛋白加合物，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的免疫損傷。既往研究發(fā)現(xiàn)，SOD、MDA與肝臟脂質(zhì)沉積量的相關(guān)〔2〕，脂肪肝模型兔SOD明顯下降，MDA明顯增加〔3〕。SOD、MDA與H2S、NO濃度的關(guān)系國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。本文通過高脂飼料飼養(yǎng)建立不同程度兔NAFLD，觀察NAFLD兔血漿 SOD、MDA、H2S、NO關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般材料 40只日本大耳白兔(月齡相似，雌雄各半)，體質(zhì)量(2.2±0.2)kg，湖北醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào):No.00006546)。實(shí)驗(yàn)地點(diǎn):湖北醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，湖北省十堰市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(設(shè)施使用證明號(hào):No.00008391)。普通飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。高脂飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心按實(shí)驗(yàn)配方配制成成品使用(配方:86%普通飼料+2%膽固醇+6%蛋黃+6%豬油)。膽固醇購(gòu)自北京雙旋生物培養(yǎng)基制品廠(批號(hào):2009.07.15)。豬油由市售板油自行煉制而成。蛋黃粉市售雞蛋自行制作。SOD、MDA、NO檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成科技有限公司。

1.2 造模及分組 兔購(gòu)入普通飼料飼養(yǎng)觀察1 w，無不良反應(yīng)后，隨機(jī)數(shù)字法將40只兔分為3組。重度NAFLD組(重度組，n=14):每兔每天高脂飼料160 g。輕度NAFLD組(輕度組，n=13):每兔每天高脂飼料80 g+普通飼料80 g。對(duì)照組(n=13):每兔每天普通飼料160 g。上午9時(shí)、下午5時(shí)各組分別投入一半飼料。全部動(dòng)物單籠、單兔喂養(yǎng)，自由飲水。建立重度、輕度NAFLD模型、對(duì)照模型。實(shí)驗(yàn)周期為13 w。重度高脂血癥組飼養(yǎng)至9 w時(shí)死亡1只，由于無相關(guān)血液標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)時(shí)將重度組死亡動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)前資料剔除，各組實(shí)有動(dòng)物13只。

1.3 標(biāo)本采集與檢測(cè) 試驗(yàn)結(jié)束，10%的水合氯醛耳緣靜脈麻醉，腹主動(dòng)脈采集血液5 ml于肝素管，離心取血漿，血漿保存于－20℃的冰柜中待檢。檢測(cè)血漿SOD(黃嘌呤氧化酶法)、MDA(TBA法)、NO(硝酸還原法)。血漿H2S(去蛋白法)檢測(cè)標(biāo)本送北京大學(xué)生理學(xué)系檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)以±s表示，治療前后組內(nèi)及組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血漿H2S水平 重、輕度組血漿H2S較對(duì)照組明顯下降(P＜0.01);重度組低于輕度組但無差異(P＞0.05)。見表1。

表1 三組兔飼養(yǎng)后MDA、SOD、H2S、NO變化( ± s，n=13)

表1 三組兔飼養(yǎng)后MDA、SOD、H2S、NO變化( ± s，n=13)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與輕度組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 MDA(noml/ml) SOD(EAU) H2S(μmol/L) NO(μmol/L)重度組 4.42±1.572)3) 46.68±12.462)4)51.12±5.972)159.32±10.12)4)3.42±1.22 80.24±9.56 77.24±2.24 92.5±16.7輕度組 3.84±1.481) 68.78±12.981) 57.51±5.872) 121.9±14.62)對(duì)照組

2.2 血漿MDA、SOD變化 重、輕度組MDA較對(duì)照組明顯增高(P＜0.01，P＜0.05)，且重度組明顯高于輕度組(P＜0.05)。重、輕度組SOD活力較對(duì)照組明顯減低，重度組明顯低于輕度組 (均P＜0.01)，見表1。

2.3 血漿NO濃度 重、輕度組NO較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，重度組高于輕度組 (P＜0.01)。表1。

3 討論

脂質(zhì)過氧化在高脂血癥導(dǎo)致以上病變的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。H2S廣泛參與機(jī)體多種生理和病理過程，且在許多器官和系統(tǒng)中發(fā)揮清除氧自由基、減少脂質(zhì)過氧化物和保護(hù)組織的作用〔4〕。本研究試圖血漿脂質(zhì)過氧化與H2S、NO的關(guān)系，為高脂血癥相關(guān)并發(fā)癥的防治提供理論依據(jù)。

內(nèi)源性H2S是體內(nèi)含硫氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸等在 5′－磷酸吡哆醛依賴酶〔包括胱硫醚－β－合酶(CBS)、胱硫醚－γ－裂解酶(CSE)〕作用下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物〔5〕。肝臟是體內(nèi)H2S生成的主要部位，對(duì)維持循環(huán)血液中H2S的濃度起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)重度、輕度NAFLD兔血漿H2S水平下降，提示肝臟H2S釋放入血下降。至于重度組和輕度組比較無差異可能與其他組織分泌的H2S干擾有關(guān)，或者有其他機(jī)制有待研究。

高脂喂養(yǎng)脂肪肝大鼠肝臟中誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(iNOS)活性增強(qiáng)，以及誘導(dǎo)生成的NO水平也增高，iNOS、NO在脂肪肝肝損害中發(fā)揮重要作用〔6〕。NO過低，導(dǎo)致機(jī)體生理功能紊亂，過高則作為一種自由基對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害〔7〕。本研究的缺陷是沒有研究?jī)?nèi)皮型一氧化氮合酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)。

SOD、MDA改變提示隨NAFLD進(jìn)展，過氧化反應(yīng)上升，抗氧化能力下降。本研究提示，與SOD/MDA抗氧化/過氧化平衡相同，H2S/NO是抗氧化/過氧化平衡氣體信號(hào)分子，在高脂血癥相關(guān)性疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，值得深入關(guān)注。

1 耿 彬，閆 輝，鐘光珍，等.硫化氫——心血管功能調(diào)節(jié)的新型氣體信號(hào)分子〔J〕.北京大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2004;36(1):106.

2 王一平，譚華炳，賀 琴，等.SOD、MDA與肝臟脂質(zhì)沉積量的相關(guān)性研究〔J〕. 西南國(guó)防醫(yī)藥，2009;19(4):365－7.

3 王 威，江海濤，史 紅，等.疏肝導(dǎo)濁方對(duì)脂肪肝家兔的 AST、ALT、ALP、NO、SOD 和 MDA 的影響〔J〕.天津中醫(yī)藥雜志，2010;27(1):9－11.

4 王洪瑾，李 毅.硫化氫與氧化應(yīng)激〔J〕.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2011;24(4):433－6.

5 Truong DH，Mihajlovic A，Gunness P，et al.Prevention of hydrogen sulfide(H2S) －induced mouse lethality and cytotoxicity by hydroxocobalamin(vitamin B(12a)〔J〕.Toxicology，2007;242(1):16－22.

6 呂天英，盧震亞.非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織NO和iNOS的變化〔J〕. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009;21(4):9－11.

7 Cary SP，Winger JA，Derbyshire ER，et al.Nitric oxide signaling:no longer simply on or off〔J〕.Trends Biochem Sci，2006;31(4):231－9.