郝祥俊 高雅然 董 昕 孫 陽 孫美玉 朱 丹 鄭紀寧 (承德醫(yī)學院，河北 承德 067000)

多藥耐藥(MDR)1基因及其表達產物P170糖蛋白過度表達所介導的對抗癌藥物的多藥耐藥性是影響化療敏感性的重要因素〔1〕。另外也有研究證實，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是影響大腸癌以5－Fu為基礎的化療方案的關鍵酶。近年來關于基因多態(tài)性與大腸癌化療敏感性的研究越來越多，然而關于亞甲基四氫葉酸還原酶基因的多態(tài)性與大腸癌化療敏感性的研究國內尚未報道。本實驗將對大腸癌組織中MTHFR基因C677T多態(tài)性與P170糖蛋白表達的相關性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 收集承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院2009年6～12月經外科手術切除并經病理證實的化療前的大腸癌組織標本55例，男31例，女24例;年齡35～73歲，平均年齡56.7歲，所有患者均為首次發(fā)現(xiàn)大腸癌，術前均未接受化療、放療等治療。大腸癌組織病理學分級按組織分化程度分為高、中和低分化腺癌，其中高分化腺癌9例，中分化腺癌40例，低分化腺癌6例。以上研究個體均為無血緣關系的承德地區(qū)漢族人。所有病例化療前分別取組織2 cm×2 cm×1 cm和25 mg，前者放入10%中性甲醛溶液固定備用，后者放入－80℃冰箱保存。

1.2 免疫組化染色方法 標本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，經脫蠟，脫苯，水化后采用 S－P法免疫組織化學方法檢測大腸癌組織中P170的表達情況。一抗為鼠抗人單克隆抗體P170(1∶100)，以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性片作為陽性對照。

1.3 結果判斷 P170主要表達于細胞膜。光學顯微鏡下以細胞膜或細胞質出現(xiàn)均勻一致的黃色或棕黃色顆粒作為陽性反應。觀察5個400倍視野，記錄每個視野腫瘤細胞的染色情況，計算陽性細胞百分率，取平均值。根據試劑說明書的標準要求，陽性細胞所占百分率對表達程度進行評估，陽性細胞數(shù)小于10%定為陰性(－)，大于或等于10%定為陽性(+)。

1.4 基因多態(tài)性檢測 用動物組織基因組提取試劑盒提取組織DNA，置于－30℃低溫冰箱保存，備用。用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態(tài)性技術(PCR－RFLP)技術檢測大腸癌組織MTHFR C677T 基因型，所用引物為 5′－TGAA GGA GAAGGTATCTGCGGGA－3′和 5′－AGGACGGTGCGGTGAGAGTG－3′。 反應總體積 25 μl，含引物(25 pmol/μl)各 0.5 μl、4 × dNTP(各2.5 mmol/μl)25 μl、Tap 酶 1 U、基因組 DNA 溶液 1 μl、10 × 緩沖液(含MgCl2)2.5 μl。PCR產物用Hinfl內切酶在37℃消化3 h，用4%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙啶染色確定MTHFR C677T基因型?；蛐头譃橐吧图兒献?C/C，198 bp)、雜合子(C/T，198/175 bp)、變異型純合子(T/T，175 bp)三種類型。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 不同分化程度大腸癌組織中P170糖蛋白的表達與臨床病理指標的關系 高、中、低分化的大腸癌組織中P170的陽性表達率分別為 44.4%(5/9)、52.2%(19/40)、33.3%(4/6)。P170糖蛋白在大腸癌組織中的表達與大腸癌的分化程度無相關性(χ2=0.86，P ＞0.05)。見圖1。

圖1 P170在不同大腸癌組織中表達情況對比(×200)

2.2 MTHFR C677T基因多態(tài)性與P170糖蛋白表達的關系C/C基因型16例，C/T基因型33例，T/T基因型6例，其中C677T T/T基因型P170糖蛋白的陽性表達率為0，顯著低于C/T基因型的陽性表達率(60.6%，χ2=7.464，P＜0.05);同時又顯著低于C/C基因型的陽性表達率(62.5%，χ2=6.875，P＜0.05);C/T基因型和C/C基因型之間沒有相關性(χ2=0.016，P＞0.05)。見圖2。

圖2 基因型分析

3 討論

大腸癌的病情發(fā)展緩慢，早期不易發(fā)現(xiàn)，治療多采用手術與化療相結合的綜合治療方法，但化療效果不盡相同。MDR是造成化療失敗和大腸癌復發(fā)的主要原因。Yuan等〔2〕應用組織培養(yǎng)藥敏法(HDRA)在一項針對MDR基因及蛋白表達與大腸癌化療敏感性關系的研究中證明，MDR蛋白的表達在一定程度上和化療敏感性密切相關，可以作為選擇有效個體化化療方案的因素。因此可以看出，P170糖蛋白的表達程度和大腸癌細胞對化療藥物的耐藥性呈正相關，即P170表達陽性，就間接說明該患者對化療藥物不敏感;因此P170糖蛋白可以預測大腸癌的化療療效。

本實驗結果說明P170糖蛋白的表達與大腸癌的分化程度無關，P170糖蛋白的表達與MTHFR基因的多態(tài)性有關，檢測MTHFR C677T基因型可能成為預測化療效果的一個重要參考指標。本實驗的完成對臨床制定合理的化療方案、指導臨床醫(yī)生進行個體化化療、避免不必要的化療毒副作用具有指導作用。但由于此實驗涉及的患者標本例數(shù)相對較少，尤其T/T基因型的例數(shù)更少，所以今后有必要進一步擴大病例數(shù)，對這一研究結果進行驗證，以進一步提高研究結果的應用價值。

1 Ferrero JM，Etienne MC，F(xiàn)ormento JL，et al.Application of an original RT－PCR－ELISA multiplex assay for MDRI and MRP，a long with p53 determination in node－positive breast cancer panems〔J〕.Br Cancer，2000;82:171－7.

2 Yuan SQ，Zhou ZW，Liang YZ，et al.Correlation of chemosensitivity tested using histoculture drug response as say to expression of multidrug resestence genes and proteins in colorectal cancer tissues〔J〕.Chin J Cancer，2009;28(9):932－8.