聶慶東 張秀梅 孫宇峰 劉志遠(yuǎn) 謝 姣 (清華大學(xué)醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 00084)

近年來(lái)，隨著我國(guó)抗菌藥物的廣泛使用，病原菌的耐藥情況日趨嚴(yán)重，細(xì)菌產(chǎn)生超廣譜β－內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，是導(dǎo)致革蘭陰性菌對(duì)內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的重要機(jī)制，并給臨床抗感染治療帶來(lái)眾多問(wèn)題。肺炎克雷伯菌是引起呼吸道感染的重要病原菌之一，也是臨床常見(jiàn)的產(chǎn)ESBLs菌株〔2〕。本文對(duì)我院3年內(nèi)老年呼吸道感染患者痰液中分離出的肺炎克雷伯菌的耐藥譜進(jìn)行分析，并對(duì)其中檢出含有ESBLs質(zhì)粒的基因型進(jìn)行初步分型。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2009年1月至2011年12月本院診治的呼吸道感染老年患者496例，其中病房來(lái)源457例，門診39例;年齡61～86〔平均(71.2±10.9)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 細(xì)菌培養(yǎng)依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，按常規(guī)方法進(jìn)行。細(xì)菌鑒定在API全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)中進(jìn)行。血瓊脂、中國(guó)蘭及M－H瓊脂培養(yǎng)基為北京市陸橋公司產(chǎn)品。

1.2.2 藥敏實(shí)驗(yàn) 采用K－B紙片擴(kuò)散法，藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品。

1.2.3 ESBLs檢測(cè) 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦的雙紙片和表型確證試驗(yàn)(頭孢他啶加克拉維酸，頭孢噻肟加克拉維酸)檢測(cè)肺炎克雷伯菌是否產(chǎn)ESBLs。

1.2.4 ESBLs基因型檢測(cè) 提取培養(yǎng)后的肺炎克雷伯菌總DNA，采用PCR方法對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株進(jìn)行初步基因分型。PCR擴(kuò)增體系為:DNA模板，1×PCR緩沖液(含 MgCl2)，0.5 μmol/L上、下游引物，0.25 mmol/L dNTP，1 U Taq DNA 聚合酶，總體積25 μl。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min、94℃變性30 s、55℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，25 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。ESBLs型特異性引物均由生工生物工程(上海)有限公司代為合成，基因組提取試劑盒購(gòu)自北京TIAGEN生化科技有限公司;PCR試劑盒來(lái)自大連寶生物工程有限公司。見(jiàn)表1。

表1 ESBLs基因型鑒定引物

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌檢出率 496份痰液標(biāo)本中病原菌培養(yǎng)陽(yáng)性377例，檢出率為76.0%;病房來(lái)源的361例，門診來(lái)源僅16例。其中，分離出的肺炎克雷伯菌45株，占11.9%，其他檢出率較高的病原菌為銅綠假單胞菌(20.1%)、金黃色葡萄球菌(9.8%)、鮑氏不動(dòng)桿菌(8.2%)及大腸埃希菌(7.9%)等。

2.2 肺炎克雷伯菌的耐藥性檢測(cè) 藥敏實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌對(duì)大部分抗生素還保持著較高的敏感性，尤其是對(duì)亞胺培南、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星、阿米卡星的敏感性都保持在90%以上，僅對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦及復(fù)方新諾明耐藥率高，達(dá)60%以上。見(jiàn)表2。

表2 45株肺炎克雷伯菌的對(duì)抗菌藥物的耐藥率(%)

2.3 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌株的基因分型 采用紙片法在45株肺炎克雷伯菌中鑒定出產(chǎn) ESBLs菌14株，檢出率達(dá)31.1%。通過(guò)PCR方法對(duì)這14株的ESBLs基因型進(jìn)行了初步分型，結(jié)果顯示僅1株為單基因型，92.9%為雙基因或多基因型，檢出的基因型中以質(zhì)粒誘導(dǎo)酶(TEM)、頭孢噻肟酶(CTXM－14)和 β－內(nèi)酰胺耐藥相關(guān)酶(SHV)為主，分別為 7例(50%)、10例(71.4%)和6例(42.9%)，而 ESBLs基因型為CTX－M－1、CTX－M－2 及 OXA 的 僅 分 別 占 28.6%、7.1% 和7.1%。見(jiàn)表3。

表3 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌株基因型分析

3 討論

呼吸道感染是老年患者最常見(jiàn)的感染，且臨床抗菌藥物的不合理應(yīng)用導(dǎo)致耐藥菌株增多。與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)結(jié)果相似〔3，4〕，本地區(qū)老年患者呼吸道感染以革蘭陰性菌為主。通過(guò)耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦及復(fù)方新諾明耐藥率高，達(dá)60%以上，與其他報(bào)道相接近〔4〕。目前，青霉素類抗生素耐藥已成了細(xì)菌感染治療的一個(gè)普遍現(xiàn)象。此外，藥敏結(jié)果中顯示肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南、呋喃妥因及阿米卡星等抗生素高度敏感，提示碳青霉烯類及酶抑制劑復(fù)合藥物對(duì)肺炎克雷伯菌有較好的抗菌作用，可作為青霉素耐藥后的替代藥物使用。而對(duì)頭孢菌素耐藥率也較低，這可能與本院第三代頭孢菌素的規(guī)范化使用有關(guān)。

肺炎克雷伯菌最常見(jiàn)的耐藥機(jī)制是產(chǎn)ESBLs，水解青霉素及頭孢菌素類的抗生素，造成多藥耐藥，而ESBLs是β－內(nèi)酰胺酶中重要的一類。本研究顯示，近3年內(nèi)的產(chǎn)ESBLs株占臨床分離肺炎克雷伯菌的31.1%，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)分離的產(chǎn)ESBLs株相比偏低〔5，6〕，這種陽(yáng)性率的差異與不同地區(qū)或不同醫(yī)院使用第三代頭孢菌素的種類、數(shù)量及時(shí)間不同而造成ESBLs的篩選及誘導(dǎo)不同有關(guān)。目前，發(fā)現(xiàn)的ESBLs依據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能主要包括TEM、SHV、鄰氯青霉素水解酶(OXA)、CTX－M 和其他一些少見(jiàn)類別〔7〕，根據(jù)氨基酸序列相似性又可以將CTX－M型ESBLs分為 3 個(gè)主要亞組〔8〕，分別為 CTX－M－1 型(CTX－M－1、CTX－M－3、CTX－M－10、CTX－M－15 及 CTX－M－23 等)，CTX－M－2 型(CTX－M－2、CT X－M－4、CTX－M－5、CT X－M－6、和 TOHO－1 等) 及CTX－M 9 型(CTX－M－9、CTX－M－13、CTX－M－14、CTX－M－19 及 TOHO－2等)。本研究結(jié)果表明鑒定出的14株ESBLs陽(yáng)性菌株中，以CTX－M－14檢出率最高，占71.4%，TEM 型和SHV型其次，分別為50%和42.9%，此結(jié)果與深圳地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果相似〔9〕。與過(guò)去研究的本社區(qū)大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs的亞型不同，本次檢測(cè)的肺炎克雷伯菌SHV型較多，而CTX－M－1型較少，從而反映了ESBLs在不同菌屬內(nèi)的偏向性。本研究還發(fā)現(xiàn)有92.9%的ESBLs陽(yáng)性菌株中同時(shí)攜帶2種或以上的β－內(nèi)酰胺酶基因，含有多種β－內(nèi)酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌的耐藥譜一般都會(huì)拓寬，而且還能通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)導(dǎo)致多重耐藥的傳播和流行。

隨著抗菌藥物的廣泛使用，不同地區(qū)和醫(yī)院因其使用抗菌藥物的不同，流行的ESBLs基因型也不盡相同，因此，了解本地區(qū)肺炎克雷伯菌的耐藥情況及ESBLs基因型的資料，將有助于預(yù)測(cè)未來(lái)耐藥趨勢(shì)，從而指導(dǎo)臨床更合理地用藥。

1 劉行超，曾桂芬，賀 英.老年患者下呼吸道感染病原菌分布及耐藥性分析〔J〕.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010;20(3):430－2.

2 賴國(guó)祥，林慶安，黃梁滸，等.老年下呼吸道感染患者肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌耐藥性分析〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2003;22(3):146－9.

3 陳玉玉，張秋桂，顏向軍.老年患者呼吸道感染病原菌分布及耐藥性監(jiān)測(cè)〔J〕. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010;20(23):3804－5.

4 李 靜，鐘啟平.老年患者下呼吸道感染病原菌分布及藥敏分析〔J〕. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009;15(2):216－8.

5 郝維敏，秦淑國(guó)，王 維，等.宿州市大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的檢測(cè)及基因型分布〔J〕.臨床輸血與檢驗(yàn)，2007;9(4):305－9.

6 黃 烈，韋潔宏，張銀輝，等.大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs表型與基因型分析〔J〕.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009;19(1):17－20.

7 Bradford PA.Extended－spectrum beta－lactamases in 21st century:characterization，epidemiology，and detection of this important resistance threat〔J〕.Clin Microbiol Rev，2001;14(4):933－51.

8 Bonnet R.Growing group of extended－spectrum beta－lactamases:the CTX－M enzymes〔J〕.Antimicrob Agents Chemother，2004;48(1):1－14.

9 張阮章，盧月梅，胡玉華，等.產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌呼吸道分離株的基因分型及耐藥性分析〔J〕.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2010;22(7):646－8.