常振華，黃潔萍，徐 蘋，李 冉，張潤鋒，陳 宏，雷初朝＊

（1.渭南職業(yè)技術學院，陜西 渭南 714000；2.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；3.湖北師范學院生命科學學院，湖北 黃石 435002）

中國黃牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛，起源上包括普通牛和瘤牛兩個牛種，二者的共同祖先是原牛。作為世界牛品種資源寶庫的重要組成部分，我國地方黃牛品種具有豐富的遺傳多樣性［1］。牛在人類文明的發(fā)展和進步中發(fā)揮著重要的作用而且也是最具有經(jīng)濟價值的家畜之一。為了更好地分析家牛的起源和分布，人們提出了不同的理論。現(xiàn)在普遍認同的“雙重馴化”觀點認為，由于氣候環(huán)境和牛群生理特征的不同，普通牛起源于新月形地區(qū)，而具有肩峰的瘤牛則起源于干旱的印度次大陸［2］。

中國黃牛品種資源十分豐富，適應性強，肉質(zhì)良好，特別是黃河中、下游流域的許多品種或群體經(jīng)過長時間的選育，其肉用性能更好。我國黃牛足跡遍布全國，分布于我國的29個省、自治區(qū)和直轄市，根據(jù)地域可以分為北方黃牛、南方黃牛和中原黃牛三大類［3］。

國內(nèi)外動物遺傳學家一直對中國黃牛的起源進化與遺傳多樣性的課題有著濃厚的興趣。目前認為，我國黃牛為多元起源的，但究竟于何時何地起源于哪幾個牛種，觀點各不相同。自20世紀80年代以來，眾多學者對我國地方黃牛的染色體核型進行了分析，指出不同黃牛品種的Y染色體形態(tài)具有明顯的多態(tài)性，包括中部（亞中部）著絲粒和端部著絲粒Y染色體，從而陳宏等［4］指出我國地方黃牛具有普通牛和瘤牛兩種血統(tǒng)；陳幼春等［5］認為我國地方黃牛起源于普通牛和瘤牛，同時在嶺南地區(qū)和東南沿海的地方黃牛發(fā)現(xiàn)有印度尼西亞爪哇牛的血統(tǒng)。mtDNA D－loop序列分析表明，中國黃牛主要有普通牛和瘤牛兩種母系起源［6，7］。動物的Y染色體遵循父系遺傳，單倍型完整，不易受重組和回復突變的影響，突變率低，是進化事件的忠實記錄者，是研究動物父系起源及遷徙路線的理想工具。微衛(wèi)星序列（STR）是指以1～6個核苷酸為基本重復單位的串聯(lián)重復序列，其長度一般在200bp以內(nèi)［8］。近年來，家牛Y染色體微衛(wèi)星多態(tài)性（Y－STR）研究把牛分為普通牛和瘤牛兩種父系起源［9，10］。家牛Y染色體基因組測序基本完成，這樣就使得許多Y染色體特異性DNA標記被鑒定，并且用于研究家牛起源、馴化及遷徙。

國內(nèi)利用Y－STR標記研究黃牛Y染色體分子遺傳多樣性與起源進化的報道不多［11，12］，因此，本研究利用2個經(jīng)典的家牛Y－STR標記檢測中國黃牛的Y染色體多樣性，其結(jié)果為建立我國地方黃牛品種資源分子遺傳多樣性數(shù)據(jù)庫、遺傳資源保存策略與肉牛新品種培育提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

按照隨機典型抽樣的方法，本研究選擇來自三大類地區(qū)的16個中國地方黃牛品種，其中北方黃牛：哈薩克牛、安西牛和蒙古牛；中原黃牛：早勝牛、晉南牛、魯西牛、秦川牛、郟縣紅牛和渤海黑牛；南方黃牛：南陽牛、宣漢牛、吉安牛、海南牛、皖南牛、雷州牛和恩施牛。總計284頭公牛樣本，其中244頭血樣，40個組織樣（脾臟和耳尖），另外采集緬甸黃牛4頭公牛及3頭秦川牛母牛的血樣作對照。

1.2 方法

1.2.1 黃?；蚪MDNA的提取與Y－STRs位點的選擇 本研究采用常規(guī)的酚－氯仿法提取基因組DNA，并且選用了家牛2個經(jīng)典的Y－STRs位點，即INRA189和BM861標記用以研究中國黃牛的父系起源，各標記的相關信息見表1，其引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 家牛2個Y－STRs位點的名稱、位置、重復類型、退火溫度與引物序列

1.2.2 黃牛Y－STRs位點的PCR體系與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳多態(tài)性分析 2個黃牛Y－STRs標記的PCR擴增總體積均為12.5μL／個體，PCR擴增程序為常規(guī)程序：95℃預變性4min；94℃變性30s，59℃退火60s，72℃延伸90s，35個循環(huán)；72℃充分延伸10min，4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物通過30%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離帶型，Marker為pBR322；然后預電泳10min，再用120V恒壓預電泳10min后80V恒壓電泳過夜；凝膠用0.1%硝酸銀染色，2% 氫氧化鈉和甲醛顯色，用Discovery Series Quantity One Software Version4.3.1軟件（Bio－Rad Laboratories Inc）進行片段大小統(tǒng)計和基因型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國黃牛的Y－STR多態(tài)性

本研究利用2個家牛Y染色體微衛(wèi)星標記（INRA189和BM861）檢測中國黃牛16個品種284頭公牛和4頭緬甸黃牛公牛共計288頭黃牛的遺傳多態(tài)性。結(jié)果表明，2個Y－STR標記INRA189和BM861在中國黃牛中各檢測到3個等位基因（圖1），表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性。在INRA189位點中，中國黃牛的3個等位基因大小分別為166、156和144 bp。其中瘤牛的等位基因大小為156／144bp，普通牛為166／156bp；在BM861位點中，中國黃牛的3個等位基因大小分別為187、169和167bp，其中瘤牛在該位點的等位基因大小為187／167bp，普通牛為187／169bp（表2和圖1）。表明這2個Y－STR位點可以很好地區(qū)分中國黃牛中的普通牛與瘤牛起源。

表2 兩個牛Y－STR標記的等位基因數(shù)及其變異范圍

2.2 普通牛和瘤牛在中國黃牛中的分布頻率

通過分析2個Y－STR位點，可以把中國黃牛分為普通牛與瘤牛兩個父系起源，同時發(fā)現(xiàn)它們的頻率在不同的品種間各不相同（表3）。總的來說，在中國16個黃牛品種中，普通牛單倍型頻率為57%（162／284），高于瘤牛單倍型頻率43%（126／284）。在北方牛群體中，普通牛單倍型頻率占優(yōu)勢（98.3%），在南方牛群體中，瘤牛單倍型頻率占優(yōu)勢（76.1%），而中原黃牛群體包括普通牛和瘤牛起源，其中普通牛單倍型頻率（63.8%）高于瘤牛單倍型頻率（36.2%）。

圖1 黃牛2個Y－STR標記的基因分型

在北方牛群體中，蒙古牛和哈薩克牛的普通牛單倍型頻率最高，均為100%，安西牛為96.4%。在南方牛群體中，宣漢牛、皖南牛、海南牛和對照組緬甸牛的瘤牛單倍型頻率均為100%，而吉安牛、南陽牛、雷州牛和恩施牛的瘤牛單倍型頻率分別為28.6%、29.0%、86.4%和88.9%。在中原黃牛6個品種中，其中5個品種具有普通牛和瘤牛起源。說明中國黃牛中的普通牛和瘤牛在中原地區(qū)交匯，普通牛頻率自北向南逐漸減少，瘤牛頻率自北向南逐漸增加。

表3 中國16個地方黃牛品種和緬甸牛的普通牛和瘤牛分布頻率

3 討論

3.1 中國黃牛的Y染色體類型多態(tài)性

根據(jù)染色體形態(tài)與類型，將中國地方黃牛Y染色體分為三大類：①北方黃牛均為中部或亞中部著絲粒Y染色體，屬普通牛起源；②南方黃牛均為（近）端部著絲粒Y染色體，屬瘤牛起源；③中原黃牛存在中部或亞中部著絲粒和（近）端部著絲粒Y染色體，屬于普通牛與瘤?；旌掀鹪矗?］。

3.2 中國黃牛的mtDNA母系起源多樣性

Lei等［7］分析了231頭黃牛的線粒體DNA D－loop區(qū)遺傳多樣性，指出中國黃牛有普通牛和瘤牛兩種血統(tǒng)。Lai等［13］研究了14個中國黃牛品種的84個個體，發(fā)現(xiàn)中國黃牛有普通牛和瘤牛兩大支系，同時這兩個支系可以細分成更多的小支系。

3.3 中國黃牛的Y－STR多態(tài)性

近年來，國內(nèi)專家利用Y染色體特異性微衛(wèi)星標記研究中國地方黃牛遺傳多態(tài)性與父系起源。張志清［14］從10個 Y－STR標記中篩選出 UMN2404和INRA124兩個標記，在秦川牛、南陽牛、晉南牛和魯西牛中呈現(xiàn)多態(tài)，并且發(fā)現(xiàn)有瘤牛和普通牛兩種父系起源。Cai等［11］對中國15個地方黃牛品種的310頭公牛進行Y－STR多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)2個Y－STR位點UMN2404和UMN0103具有明顯的多態(tài)性，可以區(qū)分瘤牛和普通牛起源。辛亞平［12］對中國13個黃牛品種的19個Y－STR分析，發(fā)現(xiàn)有3個Y－STR位點INRA124、UMN2404和UMN0103可以區(qū)分瘤牛和普通牛起源。然而INRA124位點已經(jīng)被證明在公牛與母牛中均可以擴增出相同大小的等位基因，表明這個位點不是Y染色體上特有的，不能用來區(qū)分普通牛和瘤牛起源［15］。

兩個Y染色體微衛(wèi)星位點INRA189和BM861是區(qū)分家牛中普通牛和瘤牛的經(jīng)典標記［16，17］。在中國黃牛中這兩個位點也表現(xiàn)出多態(tài)，在INRA189位點，發(fā)現(xiàn)3個等位基因，其大小分別為166、156和144bp，其中瘤牛的等位基因大小為156／144bp，普通牛為166／156bp；在BM861位點中，中國黃牛的3個等位基因大小分別為187、169和167bp，其中瘤牛在該位點的等位基因大小為187／167bp，普通牛為187／169bp。表明這2個Y－STR位點可以很好地區(qū)分中國黃牛中的普通牛與瘤牛父系起源。雖然這兩個位點的等位基因大小和Edwards等［17］發(fā)現(xiàn)的不同，她們發(fā)現(xiàn)INRA189位點的大小在90～106bp之間，BM861位點的大小為156和158 bp；但是與Liu等［18］研究的INRA189和BM861的結(jié)果相似，這是因為研究的方法不同引起的。

綜合前人的研究，本研究發(fā)現(xiàn)北方牛群體中普通牛單倍型頻率較高，瘤牛在南方牛群體中較高；而在中原黃牛中普通牛和瘤牛同時存在。這種基因流動模式的形成可能是由歷史事件、地理隔離以及氣候環(huán)境差異等造成的。這再次證明，中國黃牛主要血統(tǒng)來源于普通牛和瘤牛，并在中原地區(qū)匯合。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)2個Y－STR標記 （INRA189和BM861）可以很好地區(qū)分中國地方黃牛中的普通牛和瘤牛起源。中國地方黃牛品種的Y染色體單倍型頻率各不相同。北方牛群體中普通牛單倍型頻率較高，瘤牛在南方牛群體中較高，在中原黃牛中普通牛和瘤牛同時存在。

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