劉雪芹， 宋慧芳， 陸 利

(山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，山西 太原 030001)

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)是存在于骨髓中的成體干細(xì)胞，因具有易獲得、低免疫原性等特點成為醫(yī)學(xué)組織工程理想的種子細(xì)胞[1－2]。然而，與體細(xì)胞相似hBMSCs也存在復(fù)制性衰老，因而限制了hBMSCs的臨床應(yīng)用。我們近期研究[3]顯示蛋白酶體功能障礙與hBMSCs老化進程密切相關(guān)，應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132能夠誘導(dǎo)早期hBMSCs細(xì)胞增殖能力下降，出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，其潛在的調(diào)控機制亟待闡明。p53屬于抑癌基因家族，位于染色體17p13.1，全長16～20 kb，編碼分子量為53 kD的核內(nèi)磷酸化蛋白。P53具有轉(zhuǎn)錄因子作用，在調(diào)控凋亡、發(fā)育、分化以及DNA修復(fù)等過程中扮演重要角色。有報道證實[4－5]，P53作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在細(xì)胞衰老進程發(fā)揮重要作用，抑制P53激活能夠延緩成纖維細(xì)胞老化。那么，蛋白酶體功能障礙是否可能通過激活P53，進而導(dǎo)致晚期hBMSCs細(xì)胞增殖能力降低?為驗證這一推測，我們進行了以下研究。

材料和方法

1 體外培養(yǎng)hBMSCs

hBMSCs購自 ScienCell Research Laboratory，含10%胎牛血清(HyClone)的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90%融合時進行傳代。依據(jù)體外傳代次數(shù)將hBMSCs分為早期組(第3～4代)與晚期組(≥14代)。

2 干預(yù)實驗分組

早期hBMSCs依據(jù)干預(yù)條件不同分為:(1)DMSO(二甲基亞砜)對照組;(2)MG132組:10 μmol/L蛋白酶體抑制劑MG132作用4 h;(3)P53抑制劑pifithrin－α(PFT－α)+MG132組:20 μmol/L P53抑制劑PFT－α作用1 h隨后加入終濃度為10 μmol/L MG132作用4 h。

晚期hBMSCs分為:(1)DMSO對照組;(2)PFT－α 組:20 μmol/L PFT －α 作用48 h。

3 蛋白酶體活性檢測實驗

收集早、晚期hBMSCs，用RIPA buffer提取蛋白質(zhì)，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，依照蛋白酶體活性分析試劑盒(Millipore)說明書進行操作，熒光酶標(biāo)儀(Bio－Rad)檢測分析。

4 Western blotting

收集早、晚期hBMSCs，用RIPA buffer提取蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度。取20μg總蛋白上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜，5%脫脂奶粉液封閉后加入Ⅰ抗:兔抗P53(1∶400，Santa Cruz)，兔抗 β －actin(1∶2000，康為世紀(jì)生物科技有限公司)4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗兔Ⅱ抗室溫雜交2 h(1∶5000，中杉金橋)，按照化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(GE Healthcare Life Science)說明書曝光顯影于膠片。

5 BrdU摻入實驗檢測hBMSCs增殖能力

含 BrdU(終濃度 10 μmol/L)10%FBS-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞72 h，4%多聚甲醛室溫20 min固定細(xì)胞，加入2 mol/L HCl 37℃水浴10 min使DNA變性，鼠抗 BrdU(1∶100，Abtech Biotechnology)4 ℃孵育過夜，山羊抗鼠Cy3(1∶100，Invitrogen)37℃孵育2 h，DAP封片液封片，Olympus熒光顯微鏡計數(shù)、拍片。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

收集細(xì)胞，70%冷乙醇4℃固定4 h，1000 r/min室溫離心5 min棄上清，PBS重懸細(xì)胞團，300目網(wǎng)過濾，加入50 mg/L碘化丙啶(PI)染液，室溫避光20 min后流式細(xì)胞儀進行檢測。

7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間的比較采用Oneway ANOVA方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 早、晚期hBMSCs蛋白酶體活性及P53表達變化

傳代晚期hBMSCs蛋白酶體活性較早期細(xì)胞降低31.06% ±3.67%(P ＜0.01)，見圖 1A。Western blotting結(jié)果顯示，晚期hBMSCs P53表達水平為早期細(xì)胞的 1.2倍(P ＜0.05)，見圖 1B、C，提示晚期hBMSCs伴隨蛋白酶體活性降低，P53表達上調(diào)、活性增強。

2 阻斷P53對蛋白酶體功能障礙hBMSCs增殖能力的影響

BrdU摻入實驗結(jié)果顯示，MG132組BrdU陽性率(33.36% ±2.24%)較 DMSO 對照組(72.80% ±7.46%)顯著降低(P＜0.01)，提示抑制蛋白酶體活性可抑制hBMSCs增殖潛能。PFT－α +MG132組BrdU陽性率(49.23% ±2.67%)顯著高于MG132組(33.36% ±2.24%;P ＜0.05)，提示阻斷 P53 活化能夠削弱蛋白酶體功能障礙對hBMSCs增殖能力的影響，見圖2。

Figure1.The decreased proteasomal activity(A)and elevated P53 expression(B)in late－passage hBMSCs..n=4.*P＜0.05 vs early.圖1 晚期hBMSCs蛋白酶體活性和P53的表達

Figure2.The influence of inhibition of P53 on proliferation of hBMSCs with proteasome dysfunction assayed by BrdU incorporation.BrdU－positive cells were shown in red and nuclei were counterstained with DAPI(blue).Scale bar=100 μm..n=15.＊＊P ＜0.01 vs DMSO control group;#P ＜0.05 vs MG132 group.圖2 BrdU摻入法檢測阻斷P53對蛋白酶體功能障礙hBMSCs增殖的影響

3 阻斷P53對蛋白酶體功能障礙hBMSCs細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，MG132組G1期細(xì)胞較DMSO對照組顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞減少，增殖指數(shù)顯著低于DMSO組(P＜0.01)。PFT－α+MG132組各期細(xì)胞分布與DMSO對照組相似，增殖指數(shù)顯著高于MG132組(P＜0.05)。結(jié)果提示蛋白酶體活性下調(diào)可使hBMSCs阻滯于G1期，抑制P53激活則能夠促使細(xì)胞越過G1/S轉(zhuǎn)換點，進而恢復(fù)hBMSCs增殖能力，見表1。

4 P53抑制劑對晚期hBMSCs增殖能力的影響

BrdU摻入實驗結(jié)果顯示，PFT－α組BrdU陽性率34.42% ±8.35%顯著高于DMSO對照組9.68%±5.23%(P ＜0.01)，提示抑制 P53 活性有助于維持晚期hBMSCs增殖潛能，見圖3。

表1 流F式細(xì)胞術(shù)檢測hBMSCs細(xì)胞周期分布Table1.Cell cycle distribution of hBMSCs measured by flow cytometry(%..n=4)

表1 流F式細(xì)胞術(shù)檢測hBMSCs細(xì)胞周期分布Table1.Cell cycle distribution of hBMSCs measured by flow cytometry(%..n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DMSO control group;#P ＜0.05 vs MG132 group.

Group G1 S G2/M PI DMSO 90.80±0.22 5.57±0.20 3.46±0.42 9.20±0.21 MG132 93.38±0.07＊＊ 3.33±0.14* 3.29±0.07 6.62±0.07＊＊PFT－α +MG13291.11±0.54# 4.19±0.57 4.71±0.04# 8.90±0.53#

Figure3.The effect of PFT－α on late－passage hBMSCs assayed by BrdU incorporation.BrdU －positive cells were shown in red and nuclei were counterstained with DAPI(blue).Scale bar=100 μm..n=15.＊＊P＜0.01 vs DMSO control group.圖3 BrdU摻入法檢測PFT－α對晚期hBMSCs增殖的影響

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富。hBMSCs不僅能夠向多種組織和細(xì)胞分化，而且易于外源基因的導(dǎo)入和表達，遺傳背景穩(wěn)定，已經(jīng)成為組織工程、細(xì)胞治療、基因治療等方面的研究熱點。然而，組織工程需要高濃度細(xì)胞進行移植接種，源自體內(nèi)的hBMSCs存在數(shù)量上的局限性，需經(jīng)體外擴增后用于移植治療。新近的研究與我們的報道證實[6－7]，伴隨傳代次數(shù)增多 hBMSCs出現(xiàn)老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為胞體變大、胞漿內(nèi)顆粒物聚集，細(xì)胞增殖和分化潛能下降，hBMSCs的老化現(xiàn)象直接限制了其臨床應(yīng)用。

蛋白酶體是體內(nèi)除溶酶體之外的另一重要蛋白水解體系，它通過降解泛素化的底物蛋白參與維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。我們的前期研究結(jié)果表明[3]，蛋白酶體與hBMSCs功能的維持密切相關(guān)，抑制蛋白酶體活性能夠誘導(dǎo)早期hBMSCs出現(xiàn)早衰表型;相反，若激活蛋白酶體活性則能維持hBMSCs增殖潛能和分化潛能。本研究結(jié)果也證實晚期hBMSCs蛋白酶體活性較早期細(xì)胞降低31.06% ±3.67%，應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132能夠誘導(dǎo)早期hBMSCs細(xì)胞出現(xiàn)衰老細(xì)胞的特征，表現(xiàn)為G1期細(xì)胞增多，S期和G2/M期細(xì)胞減少，細(xì)胞生長阻滯于G1期，進一步表明蛋白酶體是維持hBMSCs細(xì)胞活力的重要因素。Arslan 等[8]和 Chondrogianni等[9]研究也證明，抑制蛋白酶體活性能夠使細(xì)胞內(nèi)錯誤折疊蛋白和氧化蛋白堆積，造成細(xì)胞周期停滯，增殖能力降低，細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激的能力下降。

P53是一種短半衰期轉(zhuǎn)錄因子，其穩(wěn)定性主要由泛素－蛋白酶體水解途徑調(diào)節(jié)，P53在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、凋亡、衰老、分化等多種生物過程中發(fā)揮重要作用[10]。本研究結(jié)果顯示晚期hBMSCs伴隨蛋白酶體活性降低，P53表達水平增高，提示P53激活可能是蛋白酶體功能障礙導(dǎo)致晚期hBMSCs增殖能力降低的重要下游事件。應(yīng)用P53抑制劑PFT－α能夠削弱蛋白酶體功能障礙對hBMSCs增殖能力的影響，PFT－α +MG132組 BrdU陽性率(49.23% ±2.67%)顯著高于 MG132 組(33.36% ±2.24%)。此外，PFT－α +MG132組細(xì)胞周期分布與DMSO對照組相似，G1期細(xì)胞較MG132組減少，S期和G2/M期細(xì)胞增多，提示抑制P53激活能夠促使細(xì)胞越過G1/S轉(zhuǎn)換點，進而恢復(fù)hBMSCs增殖能力。Liu等[11]應(yīng)用p53－shRNA慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染hBMSCs，他們發(fā)現(xiàn)沉默p53基因能夠推遲hBMSCs衰老進程，p53－shRNA組細(xì)胞于第21代出現(xiàn)胞體增大、衰老標(biāo)志物β－Gal活性上調(diào)、細(xì)胞增殖能力下降等老化征象，但是單純抑制p53基因并不能使hBMSCs永生化逃離老化命運。我們在研究中發(fā)現(xiàn)P53抑制劑介導(dǎo)的保護作用僅限于蛋白酶體功能障礙的晚期hBMSCs，抑制P53激活并不能影響早期hBMSCs的增殖能力，說明晚期細(xì)胞增殖活力下降可能是由于蛋白酶體活性下調(diào)，造成P53積聚、激活等綜合作用的結(jié)果。今后仍需在蛋白質(zhì)、基因水平深入研究泛素－蛋白酶體通路及其下游事件在hBMSCs增殖過程中的調(diào)控機制，建立高效、科學(xué)的擴增方式，推動hBMSCs在組織工程學(xué)中的應(yīng)用。

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