葉立偉， 陳 嫻，武 睿， 段 亮，張昀源， 楊 霞，王海燕， 何通川，周 蘭

(重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016)

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其病因和發(fā)病機制目前并未完全闡明，目前比較明確的是幽門螺桿菌的感染與其相關，雖然抗幽門螺桿菌治療的成功使胃癌的發(fā)生已有所減低[1]，但其發(fā)病率和致死率仍位于癌癥的第4位和第2位[2]，仍然是危害人類健康的主要殺手之一，故此，我們對胃癌的基礎研究仍需不斷加強。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF－β)超家族的成員之一，最初因其能誘導骨的形成而得名。近來的研究發(fā)現該家族多個成員和腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉歸有密切的關系，已有關于抑制腦腫瘤、前列腺癌、結直腸癌的生長和促進其凋亡的報道[3－5]，我們前期研究發(fā)現BMPs對骨肉瘤也有抑制作用[6]。關于BMPs對胃癌的報道存在較大的爭議，有學者認為BMP2高表達可以促進胃癌的轉移，是預后不良的表現[7];也有報道BMP2基因甲基化失活可能與胃癌的發(fā)生相關，過表達BMP2可以抑制胃癌細胞的增殖[8－9]。為進一步探討B(tài)MP對胃癌細胞的作用，我們以重組腺病毒 AdBMP2和AdBMP9感染人胃癌MNK－45細胞，觀察MNK－45細胞的增殖、凋亡和遷移情況。

Wnt/β－catenin信號途徑與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[10]，β－catenin在胞漿中的高度聚積是該途徑活化的標志。很多研究提示在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Wnt/β －catenin被異常激活[11]。GSK －3β 是多功能的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，其功能的發(fā)揮主要受自身磷酸化位點的影響，通常認為Tyr216的磷酸化使其活化，而 Ser9的磷酸化會使其失活[12－13]，目前發(fā)現 GSK －3β 可以作用于40 多種蛋白底物，對細胞的生長、分化、遷移和凋亡均有影響[13]。為探討B(tài)MP2和BMP9對MNK－45細胞的作用機制是否是通過Wnt/β－catenin信號途徑，我們觀察了重組腺病毒AdBMP2和AdBMP9感染的MNK－45細胞β－catenin和GSK－3β的表達水平。

材料和方法

1 材料

胃癌細胞 MNK－45、重組腺病毒 AdBMP2、AdBMP9和AdGFP均由美國芝加哥大學醫(yī)學中心分子腫瘤研究室何通川教授惠贈;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自HyClone;細胞培養(yǎng)板購自Corning Costar;MTT和DMSO購自Sigma;Hoechst 33258染料購自江蘇碧云天生物技術研究所;所用的Ⅰ抗包括 BMP2、BMP9、GSK－3β、p－GSK－3β(Ser9)和β－catenin均購自Santa Cruz;兔抗羊免疫組化試劑盒PV－6002(Ⅱ抗)和DAB購自北京中杉金橋公司。

2 細胞培養(yǎng)

胃癌細胞MNK－45用DMEM，加入 10%FBS和1%青、鏈霉素，0.25%胰蛋白酶消化后置于37℃、5%CO2飽和濕度箱中培養(yǎng)，此細胞為貼壁生長型細胞。

3 實驗分組

(1)空白組:不施加任何處理因素的MNK－45細胞;(2)實驗對照組:AdGFP感染的MNK－45細胞;(3)實驗組:AdBMP2和AdBMP9分別感染MNK－45細胞。每組實驗至少重復3次。

4 方法

4.1 免疫細胞化學(immunocytochemistry，ICC) 對數生長期胃癌細胞制備細胞爬片(24孔板)，每組設3個復孔，當細胞株融合度達50%左右時分別加入適量相應的腺病毒(熒光顯微鏡下觀察感染病毒的細胞占總細胞的30%左右為宜)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)觀察和培養(yǎng)，分別于感染后48 h棄去舊培養(yǎng)基，進行ICC，具體操作見北京中杉金橋公司免疫組化試劑盒說明書(注:胞漿中有棕黃色顆粒為陽性)。實驗結果用Image－Pro Plus(IPP)6.0分析。

4.2 MTT法檢測細胞增殖能力 用0.25%胰蛋白酶消化MNK－45細胞，制成單細胞懸液，以每孔1000個接種于96孔板中，每組設6個復孔，每孔100 μL完全培養(yǎng)基，待細胞貼壁后按照實驗分組分別加入AdGFP、AdBMP2和 AdBMP9，6～8 h后換成雙無培養(yǎng)基，此時記為0 h，于24 h始用MTT法于波長為492 nm處測吸光度(A);連續(xù)檢測5 d。

4.3 Hoechst 33258熒光染色法和流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測細胞凋亡率 Hoechst 33258熒光染色法:對數生長期骨肉瘤細胞種板(24孔板)，每組設3個復孔，當細胞株融合度達60% ～70%時分別加入相應的腺病毒，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)觀察和培養(yǎng)，6～8 h后換成含1%FBS的培養(yǎng)基，此時開始計時，72 h后按照凋亡試劑盒檢測凋亡細胞，并計算凋亡率。凋亡率(%)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

FCM:取對數生長期的MNK－45細胞以2.5×105接種于T25培養(yǎng)瓶，貼壁后進行實驗干預，分組及處理方式同前。72 h后，收集各組細胞，PBS洗2次，1 mL PBS重懸細胞。30 min內送重慶醫(yī)科大學生命科學院進行檢測。

4.4 劃痕愈合實驗和Transwell小室檢測細胞遷移能力

4.4.1 劃痕愈合實驗 對數生長期MNK－45細胞種板(6孔板)，細胞融合度達70% ～80%時分別用相應的腺病毒感染，6～8 h換液，24 h后鏡下觀察感染病毒的細胞占總細胞的30%左右，并用10 μL Tips頭(Fisher)在孔的正中輕輕做十字劃痕，于72 h取出孔板，在同一觀察點處動態(tài)觀察劃痕愈合情況。比較各組細胞的愈合情況，通過測量多個點劃痕寬度，計算平均劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度－72 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

4.4.2 Transwell小室 將小室置于24孔細胞培養(yǎng)板內，超凈臺內紫外線照射過夜。用不含血清的培養(yǎng)液制備單細胞懸液，將MNK－45細胞密度調整為3×105cells/well與400 μL雙無DMEM培養(yǎng)基混勻加入上室中;在下室即24孔板內加入600 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，結晶紫染液常溫染色30 min，PBS洗3次。染色完畢后將小室自然風干，將小室膜置于載玻片上在顯微鏡下觀察、計穿膜細胞數。

4.5 Western blotting檢測蛋白的表達水平 對數生長期MNK－45細胞，細胞融合度達60% ～70%時分別用相應的腺病毒感染，6～8 h換液，24 h后鏡下觀察病毒感染情況在30%左右，此時開始計時。72 h后提取細胞總蛋白，分光光度法測蛋白濃度，每個上樣孔以200 μg的量上樣 ，所有Ⅰ抗的稀釋度均為1∶1000，按DAB試劑盒說明書進行化學發(fā)光檢測，并用Gel Doc凝膠成像儀采集圖像;用Quantity One 4.5.0軟件測定各條帶的灰度值。

5 統(tǒng)計學處理

結 果

1 重組腺病毒攜帶的目的基因BMP2和BMP9在MNK－45細胞中成功表達

ICC法示AdBMP2和 AdBMP9感染48 h后，BMP2和BMP9的表達水平明顯高于空白組和AdGFP組，IPP軟件分析棕色顆粒的吸光度值示AdBMP2組是 GFP 組的 1.89倍(P ＜0.05)，而AdBMP9組是AdGFP 組的1.67倍(P ＜0.05)，表明重組腺病毒攜帶的目的基因BMP2和BMP9在被感染的MNK－45細胞中成功表達，見圖1。

Figure1.Expression of BMP2 and BMP9 in MNK －45 cells after infected with AdGFP，AdBMP2 or AdBMP9 measured using immunocytochemistry assay(×100).圖1 免疫細胞化學檢測AdBMP2或AdBMP9感染MNK－45細胞48 h后BMP2和BMP9蛋白的表達

2 上調BMP2和BMP9表達抑制胃癌細胞MNK－45的增殖

MTT法顯示，AdBMP2組和AdBMP9組的MNK－45活細胞數在前3 d較對照組無明顯變化;AdBMP2組第4、5 d的活細胞數分別較GFP組降低34.39%和49.15%，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);AdBMP9組第 4、5 d的活細胞數分別較AdGFP組降低36.20%和56.13%，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2。這說明BMP2和 BMP9抑制MNK－45細胞的增殖，并呈時間依賴性。

3 上調BMP2和BMP9表達促進胃癌細胞MNK－45的凋亡

Figure2.Effects of BMP2 and BMP9 overexpression on proliferation of MNK－45 cells measured using MTT assay..n=3.*P ＜0.05 vs AdGFP group.圖2 BMP2和BMP9作用后胃癌細胞MNK－45增殖的變化

AdBMP2和AdBMP9作用于MNK－45細胞72 h后，Hoechst33258染色可見這2組凋亡細胞數目較空白組和AdGFP組明顯增加，AdBMP2組細胞凋亡率較AdGFP組增加2.58倍(P＜0.01);AdBMP9組細胞凋亡率較AdGFP組增加2.69倍(P＜0.01)，空白組與AdGFP組相比無明顯差異，見圖3A、C。

流式細胞術顯示，AdBMP2組和AdBMP9組凋亡細胞數目較空白組和AdGFP組明顯增加，AdBMP2組早期凋亡細胞是AdGFP組的3.22倍(P＜0.01)，晚期凋亡細胞是 AdGFP組的2.12倍(P＜0.05);AdBMP9組早期凋亡細胞是AdGFP組的1.86倍(P＜0.05)，晚期凋亡細胞是AdGFP組的5.18倍(P＜0.01);空白組與AdGFP組相比無明顯差異，見圖3B、D。Hoechst 33258染色與流式細胞術一致，提示BMP2和BMP9均可以促進MNK－45細胞的凋亡。

Figure3.The effects of BMP2 and BMP9 overexpression on apoptosis of MNK －45 cells.Apoptosis was measured using Hoechst 33258 staining(×100;A，C)and flow cytometry(B，D)after 72 h..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs AdGFP group.圖3 BMP2和BMP9作用后MNK－45細胞的凋亡情況

4 上調BMP2和BMP9表達抑制胃癌細胞MNK－45的遷移

圖4可以看出空白對照組和AdGFP組劃痕均在72 h基本愈合，而AdBMP2組和AdBMP9組可見細胞往劃痕區(qū)生長，愈合率分別是59.91% ±2.41%和49.91%±2.19%，與對照組比差異顯著(P＜0.01)，空白組與AdGFP組之間無明顯差異(P＞0.05)。

Figure4.Effects of BMP2 and BMP9 overexpression on the migration of MNK－45 cells measured by wound healing assay(×100).圖5 BMP2和BMP9作用MNK－45細胞后遷移能力的改變

圖5顯示AdBMP2組和AdBMP9組較AdGFP組的穿膜細胞數明顯減少，AdBMP2組為AdGFP組的36.84%，AdBMP9組為 AdGFP 組的38.12%，分別較AdGFP組降低61.88% 和 63.16%，差異顯著(P＜0.01)，而空白組與AdGFP組之間無明顯差異(P ＞0.05)。

以上2個實驗均表明，BMP2和BMP9均可以抑制胃癌細胞MNK－45的遷移。

Figure5.Effects of BMP2 and BMP9 overexpression on the migration of MNK－45 cells measured by Transwell chambers(×150)..n=3.＊＊P＜0.01 vs AdGFP group.圖5 BMP2和BMP9作用MNK－45細胞后遷移能力的改變

5 上調BMP2和BMP9表達促進胃癌細胞MNK－45 p－GSK－3β的表達

Western blotting檢測發(fā)現，AdBMP2和AdBMP9作用于MNK－45細胞72 h后，這2組p－GSK－3β的表達量分別較AdGFP組增加9.94倍(P＜0.01)和15.97倍(P ＜0.01)，AdGFP 組和空白對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而各組間總GSK－3β的表達量相比均無明顯差異(P＞0.05)，提示BMP2和BMP9能增加MNK－45細胞p－GSK－3β的水平，但對總GSK－3β無明顯影響，見圖6。圖6還顯示，無論AdBMP2還是AdBMP9的處理都對β－catenin的表達量無明顯影響(P＞0.05)。

Figure6.GSK －3β and β －catenin protein expression in MNK－45 cells infected with AdBMP2 and AdBMP9 for 72 h detected by Western blotting..n=3.＊＊P＜0.01 vs AdGFP group.圖6 BMP2和BMP9對 MNK－45細胞內 GSK－3β和β－catenin表達水平的影響

討 論

BMP2和BMP9作為TGF－β蛋白家族的成員，在本研究中發(fā)現，其對人胃癌細胞MNK－45的增殖具有抑制作用，并且該作用呈一定的時間依賴性;同時，能夠促進該細胞凋亡，抑制其遷移。這與我們前期研究BMPs成員對骨肉瘤的抑制和文獻報道的對結直腸癌的抑制性作用是一致的[5－6]，以上提示其在腫瘤的治療發(fā)面具有潛在的臨床價值。同時，我們發(fā)現BMP2和BMP9均能使胃癌MNK－45細胞的p－GSK－3β水平升高，但對總GSK－3β和 β－catenin的表達無明顯影響，而GSK－3β和 βcatenin都是經典Wnt/β－catenin途徑的關鍵分子，二者是否與BMPs對胃癌MNK－45的抑制作用有關呢?首先我們了解一下Wnt/β－catenin途徑:是一組胞間分泌蛋白Wnts，通過與細胞膜上Frz受體家族成員作用將信號傳到細胞內，經DVL蛋白傳至GSK－3β，使其功能受到抑制，致使β－catenin、GSK－3β和APC形成的蛋白降解復合體不能磷酸化β－catenin，繼而抑制其泛素化和降解，導致胞漿中游離的β－catenin增多，后者便進入胞核與轉錄活化因子TCF結合，啟動下游靶基因的轉錄。β－catenin是該途徑的中心分子，它在胞漿中的水平升高是該途徑激活的標志。而在本文中雖然GSK－3β發(fā)生了磷酸化失活，但是什么原因導致β－catenin的表達水平無變化呢?

一般認為 p－GSK－3β磷酸化失活有2種作用[12]，一種是使Wnt信號通路降解復合體解聚，β－catenin的磷酸化受抑制，而在胞漿中大量積聚，但是本研究中卻發(fā)現BMP2和BMP9雖然使p－GSK－3β增高，但對 β－catenin的表達影響卻不大，其原因可能是GSK－3β對β－catenin的影響本身就很復雜，它除了通過參與降解復合體影響βcatenin，也可以通過其它途徑，比如presenilin 1蛋白，在CHO、HEK293、MEF等細胞中 GSK －3β 磷酸化失活可以使presenilin 1蛋白升高，而后者通過其它分子降低細胞中β－catenin的穩(wěn)定性從而促進其降解[14]，所以p－GSK－3β增高并不一定引起βcatenin的降解。而且BMP作用后除了影響 p－GSK－3β外，是否還影響了降解復合體其它成員的功能(比如APC)導致降解復合體失活，還有待進一步驗證。因此單純的p－GSK－3β增高，對 βcatenin的表達可能影響不大，這與文獻報道的在胃癌細胞中GSK－3β的激活不參與β－catenin的代謝過程是一致的[15]。因此我們推測BMP2和BMP9對胃癌細胞MNK－45的抑制作用與β－catenin水平無關。p－GSK－3β的另一種作用是參與微管穩(wěn)定性的調控[16]，但其與BMP2和BMP9對胃癌細胞MNK－45的抑制作用是否相關還有待進一步研究。

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