傅松波 湯旭磊 楊曉梅 馬致遠(yuǎn) (蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000)

氧化應(yīng)激與糖尿病慢性微血管并發(fā)癥密切相關(guān)〔1，2〕，抗氧化劑預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥的價(jià)值為人們所關(guān)注。近年來(lái)，對(duì)中醫(yī)中藥的研究發(fā)現(xiàn)，丹參、當(dāng)歸、銀杏等制劑能抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)糖尿病腎病(DN)大鼠有保護(hù)作用，臨床應(yīng)用也有一定的效果，但仍不能抑制糖尿病患者腎損害的發(fā)生發(fā)展。白藜蘆醇(Res)是一類(lèi)主要存在于葡萄、藜蘆等植物中的多酚類(lèi)化合物，是紅葡萄酒中發(fā)揮心血管保護(hù)作用的主要功能因子〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，口服Res對(duì)環(huán)孢霉素A引起的腎毒性大鼠有保護(hù)作用〔3〕;Sharma等〔4〕給大鼠喂養(yǎng) Res，能預(yù)防丙三醇所致的急性腎衰竭，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與其抗氧化作用有關(guān);Palsamy等〔5〕發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)DN大鼠口服6 Res w，可以使尿蛋白量、血尿素氮和肌酐下降，但缺乏觀察光鏡下腎臟形態(tài)學(xué)變化以及電鏡超微結(jié)構(gòu)的改變。本研究旨在探討腹腔注射Res對(duì)早期實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎臟損害的影響，從氧化應(yīng)激的角度探討Res減輕糖尿病大鼠腎臟損害的機(jī)制，為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 白藜蘆醇購(gòu)自天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司，鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，總抗氧化力(TAC)、巰基(SH)和丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司。血糖檢測(cè)采用美國(guó)強(qiáng)生血糖儀。雄性 Wistar大鼠，體重(256.2±9.4)g，由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 糖尿病動(dòng)物模型制備、分組與處理 將Wistar大鼠隨機(jī)分三組，正常對(duì)照組(NC)9只、糖尿病組(DC)11只和白藜蘆醇治療組(Res 10 mg·kg－1·d－1)11只，三組大鼠喂以高糖高脂飼料(飼料組成:10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%常規(guī)飼料)，體重達(dá)到400 g左右時(shí)，DC和Res組給予STZ(溶于新鮮配制的0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液，pH4.5)，以30 mg/kg體重腹腔注射。72 h后尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖，以血糖≥16.7 mmol/L者確定為糖尿病模型，大鼠成模后1 w開(kāi)始腹腔注射給藥，NC和DC組給等量溶媒，用藥10 w后處死。所有大鼠自由飲水，給予高糖高脂飼料，每周稱(chēng)體重和剪尾法測(cè)血糖，不使用胰島素及其他降糖藥。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法 用藥10 w時(shí)用代謝籠收集24 h尿液，測(cè)尿蛋白排泄量。剪斷右股骨動(dòng)脈取血，測(cè)尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)，用比色法檢測(cè)丙二醛(MDA)、巰基(SH)、總抗氧化力(TAC)。大鼠處死后迅速取出左腎，去包膜稱(chēng)重，計(jì)算腎臟指數(shù)(腎重量g/體重g×1 000);取小塊腎皮質(zhì)用3%戊二醛固定，待電鏡觀察，并測(cè)定腎小球基底膜(GBMT)厚度，剩余部分制成10%的組織勻漿，待測(cè)MDA、SH和TAC。右腎置于4%多聚甲醛液中常規(guī)固定、石蠟包埋，用于常規(guī)HE染色觀察腎小球形態(tài)學(xué)改變，計(jì)算腎小球體積(MGV)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及血糖、體重變化 大鼠成模后出現(xiàn)多食、多飲、多尿、體重下降，皮毛枯黃，行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，并逐漸加重。Res對(duì)糖尿病大鼠血糖無(wú)顯著影響。實(shí)驗(yàn)中，DC組死亡2只，Res組1只。

2.2 各組大鼠血漿和腎皮質(zhì)勻漿TAC、SH和MDA含量的變化 與NC組大鼠比較，DC組血漿和腎皮質(zhì)中的MDA含量明顯升高，TAC、SH明顯降低(均P＜0.01)，Res能明顯降低糖尿病大鼠血漿和腎皮質(zhì)MDA含量，升高TAC、SH水平(P＜0.01，P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠腎臟病理超微結(jié)構(gòu)和功能的影響HE光鏡切片:DC組大鼠腎小球肥大，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，系膜區(qū)擴(kuò)大(圖1)。電鏡下可見(jiàn)腎小球基底膜明顯增厚，足突觸合消失，系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞增多，系膜外基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞腫脹(圖2)。與NC組比較，DC組血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿蛋白明顯升高;腎小球體積、腎臟指數(shù)和GMBT明顯增大、增厚(P＜0.01，P＜0.05)。見(jiàn)表2。Res治療組上述各指標(biāo)均明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 大鼠血清和腎皮質(zhì)MDA、TAC、SH的含量(±s)

表1 大鼠血清和腎皮質(zhì)MDA、TAC、SH的含量(±s)

與 NC組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與 DC組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01，下表同

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表2 Res對(duì)糖尿病大鼠GMBT、MGV、腎臟指數(shù)、血清BUN、Cr、尿蛋白的影響(±s)

表2 Res對(duì)糖尿病大鼠GMBT、MGV、腎臟指數(shù)、血清BUN、Cr、尿蛋白的影響(±s)

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圖1 各組大鼠腎小球體積形態(tài)學(xué)改變(HE，×400)

圖2 各組大鼠腎小球基底膜形態(tài)學(xué)電鏡觀察(×10 000)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用高脂高糖飼料培育肥胖大鼠，再以小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病，更符合成人2型糖尿病生理特點(diǎn)，糖尿病大鼠成模后11 w其血BUN、Cr及尿蛋白排泄水平升高，同時(shí)伴有腎小球肥大、系膜區(qū)增寬等一系列超微病理結(jié)構(gòu)改變，說(shuō)明已有糖尿病性腎臟損害，與文獻(xiàn)報(bào)道大鼠DN模型表現(xiàn)相一致〔6〕。高血糖誘發(fā)的反應(yīng)性氧自由基參與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生，在未出現(xiàn)腎臟組織學(xué)改變以前的糖尿病早期，體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物水平已明顯增高，抗氧化酶活性已明顯降低〔7〕。本研究結(jié)果表明，與正常大鼠比較，糖尿病大鼠血清和腎皮質(zhì)中的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量明顯升高，TAC、SH明顯降低，說(shuō)明糖尿病大鼠體內(nèi)持續(xù)存在著全身和腎臟局部的氧化與抗氧化失衡。氧化應(yīng)激可能直接或間接參與了糖尿病大鼠的腎臟損傷，在DN發(fā)病機(jī)制中起重要作用，那么抗氧化治療就應(yīng)該能減輕或防止糖尿病腎損傷。

Res為良好的抗氧化劑，Hung等〔8〕研究證實(shí)Res對(duì)心肌缺血保護(hù)作用是通過(guò)其抗氧化作用實(shí)現(xiàn)的，其抗氧化作用強(qiáng)于維生素E和維生素C;King等〔9〕研究證實(shí)在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)中，加入H2O2誘導(dǎo)形成的氧化應(yīng)激狀態(tài)，Res能清除ROS并抑制其增殖;Kumar等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)Res能明顯改善DM神經(jīng)病變大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的傳導(dǎo)速度;Ates等〔11〕進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Res對(duì)糖尿病神經(jīng)病變保護(hù)作用與其抗氧化作用有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠早期應(yīng)用Res，在不干預(yù)高血糖的情況下，改善糖尿病大鼠全身和腎臟局部的氧化應(yīng)激狀態(tài)可以顯著抑制糖尿病大鼠腎小球體積增大和毛細(xì)血管基底膜增厚，通過(guò)對(duì)超微病理學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，從而減少尿微量白蛋白的排泄、降低血BUN和Cr，改善腎功能。證明了Res對(duì)糖尿病大鼠早期腎損害的超微結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。Res能顯著改善糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善腎小球肥大，抑制腎小球基底膜增厚，減輕蛋白尿，從而起到防治糖尿病腎病的作用。

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