李 晶 鄢春亭 (吉化總醫(yī)院內分泌科，吉林 吉林 132021)

砷中毒可以導致動脈粥樣硬化、冠心病等，嚴重者導致腫瘤，這些疾病的發(fā)生都是以血管內皮損傷為基礎。損傷后機體的自我修復主要包括兩個方面:損傷部位周圍正常細胞的增殖和遠處正常細胞的遷移。血小板源性生長因子(PDGF)與其受體(PDGFR)結合后主要參與血管壁細胞的發(fā)育，具有促進外膜細胞、平滑肌細胞增殖和遷移作用，在血管形成后期發(fā)揮重要作用。間質溶解素1(又稱為 MMP3)是基質金屬蛋白酶(MMP)家族的重要成員，有著廣泛的分解底物，包括蛋白聚糖、纖維結合蛋白、層黏連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白等。除此之外，MMP3可以增強其MMPs的活性〔1～3〕。而基質的降解是細胞發(fā)生遷移的基礎。本課題組利用前期建立的穩(wěn)定表達PDGFRβ的豬動脈內皮細胞(PAE)細胞系〔4〕，進一步研究砷作用激活PDGFRβ通路時，MMP3基因表達的情況，為地砷病相關機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 PAE細胞，PDGFB鏈純合二聚體(PDGFBB)，人 PDGFRβ 表達質粒(PDGFRβ/pcDNA3.0)，空載質粒(pcDNA3.0)為瑞典Uppsala大學Heuchel和Heldin博士惠贈。亞砷酸鈉(NaAsO2)購于Sigma公司，F(xiàn)12培養(yǎng)基購于Gibco公司，Lipofectamine 2000 和 RNA 提取試劑(Trizol－Reagent)購自Invitrogen，RNase free DNase I 購自 Promega，RT－PCR 試劑盒購自TaKaRa，PCR Marker、瓊脂糖均為Promega公司產品，PCR引物由上海生物工程合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染 細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基中(含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)，置于5%CO2、飽和濕度、37℃條件下培養(yǎng)。指數(shù)增長期細胞，按1×105/ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，分別用人PDGFRβ表達載體(PDGFRβ/pCDNA3.0)及其空載(pCDNA3.0)質粒轉染細胞。轉染應用脂質體 Lipofectamine 2000介導的方法，按照廠家產品說明書進行。

1.2.2 細胞總RNA提取及RT－PCR檢測人PDGFRβ 應用Trizol Reagent提取細胞總RNA，用RNase free DNase I對所獲樣品進行處理，除去可能污染的DNA分子。應用RT試劑盒將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，反應條件:30℃、10 min，42℃、30 min，99℃、5 min，5℃、5 min;PCR 以得到的 cDNA 為模板進行PCR，反應總體系50 μl，取 RT反應產物10 μl加入 PCR 反應液(TaKaRa)40 μl中。人 PDGFRβ引物庫 ID為 NM_002609，上游引物序列 5′－TGATGCCGAGGAACTATTCATCT－3′;下游引物序列 5′－TTTCTTCTCGTGCAGTGTCAC－3′，擴增產物為103 bp。反應條件:94℃、2 min，94℃變性 15 s，53℃退火，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)。最后72℃、5 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳(含溴化乙啶)，拍照鑒定。用Pharmacia Image Master凝膠成像儀觀察分析基因表達的變化，結果用灰度值表示。

1.2.3 細胞損傷24 h完全修復所需PDGFBB最低濃度的測定 細胞按1×105/ml密度培養(yǎng)于24孔板中，待細胞完全匯合后，用200 μl槍頭制造劃痕，經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去游離細胞后加入不同濃度PDGFBB，無血清培養(yǎng)24 h后于共聚焦顯微鏡下觀察劃痕的修復(遷移)，測量劃痕寬度。

1.2.4 NaAsO2對細胞遷移抑制率的檢測 細胞按5×105/ml密度培養(yǎng)于24孔板中，24 h后，用200 μl槍頭制造劃痕，PBS洗去游離細胞后，每孔加入1 ml用無血清的F12(含10 μg/L PDGFBB)配制好的不同濃度(0、2.5、5、10、20 μmol/L)NaAsO2溶液，每一濃度設3個復孔，培養(yǎng)24 h。觀察細胞遷移抑制率，微分干涉(DIC)拍照。抑制率公式:(孵育后的細胞劃痕寬度/孵育前的細胞劃痕寬度)×100%。

1.2.5 細胞總RNA提取及RT－PCR檢測MMP3 mRNA表達指數(shù)增長期的細胞以5×105/ml密度培養(yǎng)于6 cm培養(yǎng)皿中，待細胞融合 80%時，加入 F12(含10 ng/L PDGFBB)配制的NaAsO2，最終濃度分別為0、5、20 mol/L，每個組別各設三組平行樣，用于RNA的提取。應用Trizol Reagent提取細胞總RNA

(按說明書提取)，用RNase free DNase I對所獲樣品進行處理，除去可能污染的DNA分子。應用RT試劑盒將提取的總RNA逆轉錄為 cDNA，反應條件:42℃、60 min，70℃、15 min，4℃、5 min;以得到的cDNA為模板進行PCR，反應總體系50 μl，取RT反應產物10 μl加入 PCR反應液(TaKaRa)40 μl中。因本實驗研究的 PAE細胞穩(wěn)定表達 PDGFRβ，所以本實驗把PDGFRβ定為內參基因。MMP3:上游引物 5′－ACGGACCTCCCCCAGCTTCC－3′;下游引物 5′－GGATCACATGTGGCCGGCGT－3′擴增產物為 88 bp。反應條件:94℃、2 min，94℃、15 s，58℃、30 s，72℃、30 s，共 40 個循環(huán)。循環(huán)結束后 72℃、5 min。PCR產物用2.5%瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳(含溴化乙啶)，拍照鑒定。用Pharmacia Image Master凝膠成像儀觀察分析基因表達的變化，結果用灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，細胞劃痕實驗檢測結果以±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 RT－PCR檢測人PDGFRβ在轉染細胞中的穩(wěn)定表達 外源人PDGFRβ mRNA只在其表達質粒轉染的細胞中呈高水平表達，對細胞進行跟蹤檢測發(fā)現(xiàn)，PDGFRβ在該細胞中持續(xù)穩(wěn)定高水平表達，而在未轉染及空載轉染細胞中均未見表達。見圖1。

圖1 PDGFRβ在各組細胞中的表達

2.2 細胞損傷24 h完全修復所需PDGFBB最低濃度的測定未加入PDGFBB的對照組劃痕寬度與培養(yǎng)前無明顯差異，均為 550 μm;5 μg/L PDGFBB 組可見劃痕寬度為 140 μm;PDGFBB≥10 μg/L時劃痕已完全修復，寬度為0 μm。即經24 h細胞劃痕完全愈合所需的PDGFBB最低濃度為10 μg/L。

2.3 NaAsO2對細胞遷移抑制率的作用 NaAsO2作用細胞24 h后，劃痕寬度隨著NaAsO2濃度的增高越來越寬，代表細胞遷移抑制率隨著NaAsO2濃度的增加而增加，其抑制作用呈明顯的劑量效應關系。2.5～20 μmol/L NaAsO2組間比較均有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

2.4 不同濃度 NaAsO2作用下 MMP3 mRNA的表達 0、5、20 μmol/L三組中 MMP－3 mRNA 表達灰度值為:4.58 ± 1.14，2.06 ± 0.37，1.12 ± 0.68。5、20 μmol/L 組與 0 μmol/L 組相比MMP－3表達下調，其中20 μmol/L組下調的更為明顯(P＜0.05)，20 μmol/L 組與5 μmol/L 組相比 MMP－3 表達也明顯下調(P＜0.05)?？梢姡琈MP－3 mRNA的表達隨著濃度的NaAsO2增加而逐漸降低，有劑量依賴效應。見圖2。

表1 NaAsO2對細胞遷移的抑制作用(n=3，±s)

表1 NaAsO2對細胞遷移的抑制作用(n=3，±s)

組間比較:1)P＜0.05

組別 劃痕寬度(μm) 抑制率(%)空白對照組 －0 2.5 μmol/L NaAsO2組 49.7 ±3.061) 23.991)5 μmol/L NaAsO2組 73.0 ±6.081) 35.271)10 μmol/L NaAsO2組 126.0 ±8.181) 60.871)20 μmol/L NaAsO2組 180.0 ±23.891) 86.961)

圖2 不同NaAsO2濃度組中MMP3 mRNA表達的RT-PCR檢測結果

3 討論

血管內皮細胞是決定血管活性的重要因素，內皮細胞的增殖和遷移是血管損傷后修復的一個重要環(huán)節(jié)，所以研究血管損傷修復需要一個實驗模型。

本實驗建立了穩(wěn)定表達人 PDGFRβ的PAE細胞，加入PDGFBB后，該通路被激活，可以引起明顯的細胞遷移〔4〕。由于PAE本身并不表達PDGFRβ，所以這個模型建立成功后，可以更好地研究砷劑影響細胞遷移是否與PDGFR通路有關。本實驗結果顯示，隨著砷濃度增加，細胞遷移受到抑制，呈現(xiàn)出劑量效應關系，說明砷中毒后破壞了血管內皮細胞的修復功能，這可能是隨著砷中毒病情的進展會導致動脈粥樣硬化，甚至腫瘤形成的一個重要原因。

MMP3的功能是調節(jié)細胞外基質的重建，可以降解幾乎全部的細胞外基質成分。正常情況下MMP3處于很低的表達水平，但在外界刺激、內環(huán)境改變(細胞因子刺激)等影響時均可引起MMP3表達的改變〔5〕。有文獻報道動脈粥樣硬化患者MMP－3表達可能受細胞因子和生長因子的調節(jié)〔6〕。本文在檢測MMP3表達時發(fā)現(xiàn)，在PDGFBB刺激下，MMP3表達增強。但是，隨著砷濃度的增加，MMP－3表達明顯下降，提示砷劑抑制PDGFR介導的細胞遷移是通過下調MMP－3來實現(xiàn)的。這個結論為砷中毒導致的心血管疾病的發(fā)生，甚至腫瘤發(fā)生的機制研究提供理論依據(jù)。

1 Woessner JF Jr.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling〔J〕.FASEB J，1991;5(8):2145－54.

2 Ogata Y，Itoh Y，Nagase H.Steps involved in activation of the pro－matrix metalloproteinase 9(progelatinase B)－tissue inhibitor of metalloproteinases－1 complex by 4－aminophenylmercuric acetate and proteinases〔J〕.J Biol Chem，1995;270(31):18506－11.

3 Libby P.Molecular bases of the acute coronary syndromes〔J〕.Circulation，1995;91(11):2844－50.

4 史艷芬，李 晶，李玉林，等.鴉膽子乙醇提取物對血小板源性生長因子受體介導細胞遷移的抑制作用〔J〕.吉林大學學報(醫(yī)學版)，2009;35(4):608－11.

5 欒朝霞，高沁怡，裴著果.洛伐他汀對血管平滑肌細胞基質金屬蛋白酶3表達的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志，2003;11(4):339－41.

6 Kanaki T，Bujo H，ORI S，et al.Functional analysis of aortic endothelial cells expressing mutant PDGF receptors with respect to expression of matrix metalloproteinase－3〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2002;294(2):231－7.ORI S，et al.