孫錫波 高 茜 程 蕊 李炳選 劉學(xué)伍 遲兆富

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青州 262500)

目前癲癇發(fā)作導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或死亡的分子機(jī)制仍不完全明確，亦缺乏有效的具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物。線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)是存在于線粒體膜上的一種鉀通道，二氮嗪(DZ)作為其特異性開放劑，能減輕組織的缺血再灌注損傷，已在多個研究得到證實(shí)〔1～4〕。然而DZ對癲癇發(fā)作導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，目前國內(nèi)外研究還很少。本實(shí)驗(yàn)我們采用氯化鋰-匹魯卡品制作大鼠顳葉癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，用DZ及mitoKATP特異性阻斷劑5-羥基癸酸(5-HD)預(yù)處理，觀察DZ對癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激的影響，探討DZ對癲癇發(fā)作是否具有神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性Wistar大鼠66只，清潔級，體質(zhì)量200～250 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，隨機(jī)分為空白對照組12只，其中6只用于HE、Nissl染色，6只用于指標(biāo)檢測。癲癇組(PILO組)、DZ組(DZ組)、DZ加5-HD組(DZ+5-HD組)，每組18只，后3組再分為2個亞組，每亞組6只，分別用于SE后24 h、48 h指標(biāo)檢測，每組剩余的6只用于HE、Nissl染色。

1.2 儀器與試劑 氯化鋰、匹魯卡品、DZ、5-HD均購自美國Sigma公司;蘇木素-伊紅購自武漢博士德公司，甲苯胺藍(lán)購自上海生工生物工程有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司;全基因組DNA抽提試劑盒購自德國Qiagen公司;大鼠 8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒購自日本Shizuoka公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物干預(yù)及癲癇模型建立 所有大鼠腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，20 h后給予腹腔注射匹魯卡品30 mg/kg，在匹魯卡品處理前30 min給予皮下注射氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg，以拮抗匹魯卡品導(dǎo)致的外周膽堿能反應(yīng)。DZ組于注射匹魯卡品前15 min給予DZ 5 mg/kg，腹腔內(nèi)注射。DZ+5-HD組于注射匹魯卡品前20 min先給予5-HD 8 mg/kg，間隔5 min后再給予DZ 5 mg/kg，二者皆腹腔內(nèi)注射。對照組用等量的生理鹽水代替匹魯卡品。觀察大鼠的行為學(xué)改變，以Racine評分標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)來判定癲癇發(fā)作級別，發(fā)作達(dá)到Ⅳ或Ⅴ級的大鼠歸為實(shí)驗(yàn)組。如果有的小組中大鼠被排除，則即補(bǔ)充相應(yīng)數(shù)量的大鼠，以保證每組的樣本量。大鼠SE持續(xù)60 min以后，通過腹腔注射地西泮10 mg/kg以終止發(fā)作。

1.3.2 取材 分別在致癇后24 h、48 h，用10%的水合氯醛100 mg/kg，將大鼠麻醉后，斷頭處死，迅速取出腦組織，在低溫修塊臺上快速分離出雙側(cè)海馬，新鮮海馬組織置于－80℃保存?zhèn)溆?，用于MDA、SOD、GSH-Px的檢測及海馬 DNA 8-OHdG的測定。用于HE染色及Nissl染色的大鼠于SE后48 h，用10%的水合氯醛100 mg/kg，將大鼠麻醉后，4%多聚甲醛主動脈灌注固定，斷頭取腦，放入固定液中后固定24 h，取海馬組織塊，脫水至蠟23 h，石蠟包埋。

1.3.3 HE染色及Nissl染色 在切片機(jī)做連續(xù)冠狀切片，切片厚度為10 μm，在溫水槽內(nèi)展片，再撈于已用鉻礬明膠包被的清潔載玻片上，在切片臺上烤片2 h后，4℃保存?zhèn)溆?。切片每?張取2張組成1套，每套約8～10張，行HE染色及Nissl染色。將組織染色切片置于光學(xué)顯微鏡下，觀察大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)及其分布。每個標(biāo)本取6張染色切片，行海馬神經(jīng)元計數(shù)，每張切片各部位均隨機(jī)觀察5個視野，取其平均值。

1.3.4 MDA、SOD、GSH-Px的檢測 取一側(cè)海馬組織，稱重，按組織與生理鹽水1∶9(W/V)的比例，置于玻璃勻漿器冰浴研磨，制備10%的組織勻漿。3 000 r/min，離心10 min，離心半徑10 cm，移液管取上清液。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，分別采用硫代巴比妥酸比色法檢測海馬組織中MDA的含量，WST-1法檢測SOD的活力，紫外比色法檢測GSH-Px的活力。

1.3.5 海馬DNA 8-OHdG的測定 海馬組織總DNA的提取按照試劑盒說明書操作，用8-OHdG ELISA試劑盒測定大鼠海馬DNA中8-OHdG的含量，該試劑盒能測量極低水平的8-OHdG的含量，所有微板接受450 nm光密度測定。8-OHdG ELISA重復(fù)3次，取其均值。結(jié)果基于每次8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)溶液試驗(yàn)的線形校正曲線計算，所得數(shù)據(jù)以每微克DNA所含的8-OHdG的皮克數(shù)表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，計數(shù)數(shù)據(jù)采用百分比表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個樣本均數(shù)比較選擇單因素方差分析，其中兩兩間比較采用最小顯著差檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)表現(xiàn) 對照組大鼠無癲癇發(fā)作。PILO組致癇成功率83.33%(15/18)，DZ組的致癇率為77.78%(14/18)，DZ+5-HD組的致癇率為83.33%(15/18)，3組間無顯著性差異(P＞0.05)。注射匹魯卡品到癲癇持續(xù)狀態(tài)的潛伏期PILO組為16～62 min，平均(37.83±15.64)min;DZ+5-HD組的潛伏期為19～58 min，平均(36.25±16.85)min;DZ組的潛伏期為27～96 min，平均(60.54±19.68)min。DZ組的潛伏期較PILO組以及DZ+5-HD組顯著延長(P＜0.05)。致癇24 h時，15只PILO組大鼠死亡5只，死亡率為33.33%;DZ+5HD組死亡4只，死亡率為26.67%;DZ組無死亡。DZ組死亡率分別與PILO組和DZ+5-HD組差異顯著(P＜0.05)。

2.2 HE染色及Nissl染色 正常對照組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)可見大量致密的錐體細(xì)胞，排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，邊緣清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富。SE后大鼠海馬神經(jīng)元損傷明顯，可見部分神經(jīng)元脫失，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，胞質(zhì)濃縮，核固縮，染色質(zhì)凝集成塊，邊集，胞漿內(nèi)尼氏小體減少。SE后48 h大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，DZ組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)目較PILO組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，DZ+5-HD組存活的神經(jīng)元數(shù)目與PILO組比較無顯著性差異(P＞0.05)，見表1。

2.3 MDA、SOD、GSH-Px檢測 PILO組及 DZ+5HD組大鼠MDA含量在SE發(fā)作后24 h、48 h均較對照組顯著升高(P＜0.05);SOD與 GSH-Px活力在SE后24 h、48 h均顯著下降(P＜0.05)。DZ組大鼠，在SE后各時間點(diǎn)海馬MDA含量均明顯低于PILO組與DZ+5HD組大鼠(P＜0.05)，海馬SOD與GSH-Px活力在SE后24 h、48 h時顯著高于PILO組與DZ+5HD組 (P＜0.05)，見表2。

2.4 海馬DNA 8-OHdG的測定 PILO組及DZ+5HD組大鼠海馬DNA 8-OHdG的含量在SE發(fā)作后24 h、48 h均較對照組顯著升高(P＜0.05);DZ組大鼠，在SE后各時間點(diǎn)海馬DNA 8-OHdG的含量均明顯低于PILO組與DZ+5HD組大鼠(P ＜0.05)，見表2。

表1 Nissl染色各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)存活的錐體細(xì)胞數(shù)(個/mm2，±s，n=6)

表1 Nissl染色各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)存活的錐體細(xì)胞數(shù)(個/mm2，±s，n=6)

與對照組比較:1)P＜0.05;與PILO組及DZ+5-HD組比較:2)P＜0.05

組別 CA1區(qū) CA3區(qū)對照組238.5±23.5 257.5±24.8 PILO組 103.4±11.51) 114.6±12.81)DZ組 198.7±18.32) 218.3±22.52)DZ+5-HD組 105.6±11.21) 116.8±12.71)

表2 各組大鼠海馬MDA、SOD、GSH-Px、DNA 8-OHdG的比較(±s，n=6)

表2 各組大鼠海馬MDA、SOD、GSH-Px、DNA 8-OHdG的比較(±s，n=6)

與對照組比較:1)P＜0.05;與同時間點(diǎn)PILO組及DZ+5-HD組比較:2)P＜0.05

組別 MDA(nmol/mg蛋白) SOD(U/mg蛋白) GSH-Px(U/mg蛋白) 8-OHdG(pg/μg DNA)對照組 13.76±2.26 195.37±13.35 69.35±8.47 5.56±0.93 SE后24 h PILO組 23.87±3.941) 170.45±16.781) 46.58±6.341) 63.34±9.621)DZ組 18.46±2.572) 183.24±17.162) 58.86±11.252) 26.45±3.792)DZ+5-HD組 23.47±4.551) 172.48±14.581) 47.35±6.821) 61.82±9.871)SE后48 h PILO組 19.66±1.861) 160.65±17.461) 52.89±7.651) 57.68±9.111)DZ組 15.34±2.682) 175.31±13.552) 62.16±11.232) 24.83±3.362)DZ+5-HD組 18.46±2.141) 162.86±16.571) 53.62±9.451) 59.31±8.541)

3 討論

8-OHdG是DNA氧化損傷的產(chǎn)物，是目前最常用的 DNA氧化損傷的檢測指標(biāo)之一。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度，并間接反映引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的自由基的水平。癲癇發(fā)作時通過脂質(zhì)過氧化與氧化應(yīng)激損傷可損傷線粒體的功能與結(jié)構(gòu)，影響呼吸鏈，進(jìn)一步增加ROS的生成，從而形成惡性循環(huán)，最終可導(dǎo)致細(xì)胞壞死或者凋亡〔5〕。

本研究結(jié)果表明大鼠SE后海馬神經(jīng)元存在氧化應(yīng)激損傷，并可能成為治療靶點(diǎn)。在缺血再灌注動物模型中mitoKATP開放劑DZ、吡那地爾等均可模擬缺血預(yù)處理的保護(hù)作用，mitoKATP阻斷劑5-HD可阻斷這種保護(hù)作用。關(guān)于mitoKATP開放劑對神經(jīng)元保護(hù)作用的機(jī)制目前尚未完全明確，Teshima等〔3〕學(xué)者研究認(rèn)為，mitoKATP通過維持線粒體膜電位而抑制神經(jīng)元凋亡從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。Sun等〔4〕研究腎臟的缺血再灌注模型后提出，mitoKATP可通過抑制線粒體生成過多的ROS從而抑制細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)臟器功能的作用。Roseborough等〔6〕研究兔脊髓缺血模型認(rèn)為，mitoKATP開放劑DZ通過降低內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，改善缺血脊髓的功能。還有的學(xué)者〔7〕認(rèn)為，mitoKATP開放劑通過防止線粒體腫脹，限制Ca2+的內(nèi)流，抑制細(xì)胞色素C的釋放而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

盡管如此，DZ是否對癲癇發(fā)作以及癲癇發(fā)作導(dǎo)致的腦損傷具有保護(hù)作用及其可能作用機(jī)制還知之甚少。本研究結(jié)果表明mitoKATP開放劑DZ能減輕大鼠SE后海馬神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷，對SE后海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。我們用5-HD后可拮抗DZ的神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步證明了DZ是通過開放mitoKATP起神經(jīng)保護(hù)作用的。本研究結(jié)果提示開放mitoKATP可能為癲癇的神經(jīng)保護(hù)提供新的前景。

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