楊 蕾 趙建軍 霍 銳 姜 洋

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院內(nèi)鏡中心，吉林 長(zhǎng)春 130033)

樹(shù)突細(xì)胞(DC)作為體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞，可以將負(fù)載于其上的腫瘤信息傳遞給免疫系統(tǒng)，激發(fā)抗腫瘤反應(yīng)來(lái)制備腫瘤疫苗〔1〕。本研究采用結(jié)腸癌細(xì)胞株總RNA轉(zhuǎn)染成熟DC(mDC)制備結(jié)腸癌疫苗，并觀察體外誘導(dǎo)的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 兔抗人癌胚抗原(CEA)抗體、異氰硫酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD83單抗(Bioscience);白細(xì)胞介素(IL)－2、IL－4、粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM－CSF)、腫瘤細(xì)胞壞死因子－α(TNF－α)(Peprotech);IL－12、干擾素(IFN)－γ 檢測(cè)試劑盒(上海森雄公司);Fermentas體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI);CEA mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體(pcDNA3.1－CEA)、CEA表達(dá)陽(yáng)性的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞株、宮頸癌Hela細(xì)胞株(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室保存)。

1.2 方法

1.2.1 外周血DC體外誘導(dǎo)與培養(yǎng) Ficoll密度梯度分離法獲得健康人新鮮血外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁獲得單核細(xì)胞，未貼壁細(xì)胞作為同種異體T細(xì)胞凍存?zhèn)溆?。用GM－CSF、IL－4細(xì)胞因子組合培養(yǎng)單核細(xì)胞5 d，將其誘導(dǎo)為未成熟DC(imDC);5 d后加入含TNF－α 10 ng/ml的IMDM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型CD83，以未加抗體的DC細(xì)胞作為對(duì)照〔2〕。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞總RNA提取及定量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，并用分光光度計(jì)定量。RNA濃度(mg/L)=A260×稀釋倍數(shù)×40。

1.2.3 CEA mRNA體外轉(zhuǎn)錄 以線性化的pcDNA3.1－CEA為模板，按照Fermentas體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書方法體外轉(zhuǎn)錄為CEA mRNA。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞總RNA體外負(fù)載DC 取mDC 1×106個(gè)，按照10 μg總RNA:2×106DC的比例，調(diào)電壓500 V、1 ms進(jìn)行電穿孔。穿孔后置入4℃冰箱靜置10 min，移入含 GM－CSF 400 U/ml、IL－4 250 ng/ml的 IMDM 培養(yǎng)基中〔3〕，37℃、5%CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h作為轉(zhuǎn)染組DC。未進(jìn)行電穿孔的mDC作為未轉(zhuǎn)染組DC。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)mDC內(nèi)CEA蛋白表達(dá) 分別收集轉(zhuǎn)染組DC和未轉(zhuǎn)染組DC，滴入多聚賴氨酸包被的載玻片，用冷丙酮固定。按照免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)DC內(nèi)CEA蛋白表達(dá)。

1.2.6 SW480總RNA負(fù)載DC后體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)及特異性細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn) 效應(yīng)細(xì)胞:取轉(zhuǎn)染組DC，調(diào)細(xì)胞密度為5×105/ml，同種異體淋巴細(xì)胞調(diào)細(xì)胞密度為2×106/ml，各取 400 μl于 24 孔板共同培養(yǎng)，并于第 1、3、5 天各加入IL－2 1 ng/ml;第7天再次加入轉(zhuǎn)染組DC刺激5 d，以誘導(dǎo)CTL作為第一組效應(yīng)細(xì)胞(SW480－CTL)。收集轉(zhuǎn)染10 μg CEA mRNA的DC，按照上述方法誘導(dǎo)CTL作為第二組效應(yīng)細(xì)胞(CEA－CTL)。未轉(zhuǎn)染組DC按上述方法與同種異體淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)獲得的細(xì)胞作為對(duì)照組效應(yīng)細(xì)胞。靶細(xì)胞:轉(zhuǎn)染CEA mRNA的DC作為靶細(xì)胞1;SW480細(xì)胞作為靶細(xì)胞2;Hela細(xì)胞作為靶細(xì)胞3。

按效靶比 40∶1、20∶1、10∶1、5∶1將各組效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞混合并加入96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別作為實(shí)驗(yàn)孔，37℃、5%CO2孵育5 h，按乳酸脫氫酶(LDH)比色法試劑盒說(shuō)明書操作，用分光光度計(jì)在510 nm處檢測(cè)吸光值。只分別加入靶細(xì)胞的為自然釋放孔，只分別加入靶細(xì)胞后再加入Triton X－100裂解細(xì)胞的為最大釋放孔。

殺傷率(%)=〔(實(shí)驗(yàn)孔OD－自然釋放孔OD)/(最大釋放孔－自然釋放孔OD〕×100%

1.2.7 ELISA法檢測(cè)誘導(dǎo)的CTL分泌IFN－γ水平 收集方法

1.2.6中的第一組效應(yīng)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染組DC誘導(dǎo)的對(duì)照組效應(yīng)細(xì)胞上清各100 μl，加入96孔酶標(biāo)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用IFN－γ試劑盒分別檢測(cè)上清中IFN－γ水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 體外誘導(dǎo)的DC形態(tài)學(xué)觀察及表型檢測(cè) mDC脫壁懸浮，體積增大不規(guī)則，有特征性毛刺狀突起，部分細(xì)胞聚集成簇。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC成熟標(biāo)志CD83表達(dá)陽(yáng)性。

2.2 SW480細(xì)胞總RNA提取及CEA mRNA體外轉(zhuǎn)錄 提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示有28S、18S、5S三條帶，說(shuō)明提取的RNA完整，A260/A280=1.9，說(shuō)明RNA純度較高，RNA濃度為0.2 mg/L。轉(zhuǎn)錄后的CEA mRNA在1 200～2 000 bp之間出現(xiàn)大小不等條帶，與CEA理論長(zhǎng)度相符。見(jiàn)圖1。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)染組DC內(nèi)胞質(zhì)染成棕黃色，而對(duì)照組沒(méi)有。由于SW480是CEA特異性表達(dá)細(xì)胞，既然CEA在DC內(nèi)表達(dá)成功，也可以認(rèn)為SW480細(xì)胞總RNA能在DC內(nèi)表達(dá)。見(jiàn)圖2。

2.4 轉(zhuǎn)染腫瘤總RNA的DC誘導(dǎo)的腫瘤特異性細(xì)胞毒效應(yīng)

負(fù)載SW480總RNA的DC誘導(dǎo)的CTL和負(fù)載CEA mRNA的DC誘導(dǎo)的CTL均能特異性殺傷有CEA蛋白表達(dá)的兩種靶細(xì)胞，即CEA靶細(xì)胞和SW480靶細(xì)胞，兩種CTL對(duì)CEA靶細(xì)胞的殺傷率無(wú)顯著性差別，但負(fù)載SW480的DC對(duì)SW480靶細(xì)胞的殺傷率顯著大于負(fù)載CEA的DC的殺傷率(P＜0.01)。各組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞均無(wú)殺傷作用。見(jiàn)圖3。

2.5 轉(zhuǎn)染SW480總RNA的DC誘導(dǎo)CTL分泌IFN－γ 轉(zhuǎn)染SW480總RNA的DC體外誘導(dǎo)的CTL上清中IFN－γ分泌量〔(142.646 7±23.997 8) pg/ml〕顯著高于對(duì)照組〔(35.946 67 ±6.112 6)pg/ml〕水平(P ＜0.01)。

圖1 pcDNA3.1-CEA體外轉(zhuǎn)錄為CEA mRNA的電泳圖

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染后DC內(nèi)CEA蛋白的表達(dá)(×400)

圖3 轉(zhuǎn)染SW480總RNA的DC誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞毒效應(yīng)

3 討論

由于DC在抗原提呈過(guò)程中的特殊地位，用不同方法使之負(fù)載腫瘤抗原，誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答來(lái)制備腫瘤疫苗，是治療腫瘤的一條有效途徑，并且在近年來(lái)成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)之一〔4〕。有關(guān)結(jié)腸癌DC疫苗的研究中有兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，即選擇負(fù)載的腫瘤抗原及選擇不同成熟階段的DC。CEA是一種腫瘤相關(guān)抗原，在結(jié)腸腺癌中高表達(dá)，一般用來(lái)作為結(jié)腸癌治療的靶目標(biāo)，目前研究最多的是用CEA多肽負(fù)載DC，在幾種抗腫瘤免疫治療的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均取得了一定的效果〔5〕;但多肽的應(yīng)用需鑒定人類白細(xì)胞抗原(HLA)分型，程序繁瑣，且腫瘤細(xì)胞容易通過(guò)腫瘤變異逃避這種針對(duì)單一抗原表位的免疫反應(yīng)，使其在臨床的應(yīng)用受到限制〔6〕。本研究采用了該領(lǐng)域中最新的核酸疫苗方法，用結(jié)腸癌細(xì)胞株的總RNA負(fù)載DC來(lái)制備腫瘤疫苗，其應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)在于:①與傳統(tǒng)疫苗相比，能激發(fā)機(jī)體更全面的免疫應(yīng)答，表達(dá)的抗原肽更接近天然構(gòu)象，抗原性更強(qiáng)。②RNA轉(zhuǎn)染只需進(jìn)入胞質(zhì)，轉(zhuǎn)染效率較高，對(duì)DC損傷較小，有利于保持DC的活性及提呈功能。③RNA可以編碼腫瘤抗原與不同的HLA等位基因結(jié)合的多個(gè)表位，因此應(yīng)用不受HLA限制。④與其他全腫瘤疫苗需大量腫瘤組織來(lái)制備的方法相比，RNA可從少量腫瘤組織中分離并擴(kuò)增而充足的獲得〔7〕，使RNA疫苗可以應(yīng)用于那些術(shù)后或腫瘤負(fù)荷很小的患者，因此更有臨床應(yīng)用前景。

DC在分化成熟過(guò)程中分為兩個(gè)階段，未受到抗原刺激時(shí)，大部分處于非成熟階段，有強(qiáng)大的抗原攝取功能;在攝取抗原或受到刺激后分化為mDC，高表達(dá)人主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(MHC－Ⅰ)、MHC－Ⅱ及共刺激分子，分泌T細(xì)胞激活所需的各種細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的抗原遞呈及T細(xì)胞激活功能。本研究中創(chuàng)新性地采用了mDC作為載體，以避免既往研究中應(yīng)用imDC可能產(chǎn)生的免疫耐受或低免疫原性反應(yīng)〔8〕;并采用電穿孔法，大大地提高了轉(zhuǎn)染效率，免疫細(xì)胞染色法及流式細(xì)胞術(shù)均證實(shí)SW480總RNA能在mDC內(nèi)表達(dá)，隨后進(jìn)行的抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染CEA mRNA的DC和轉(zhuǎn)染SW480總RNA的DC誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞均能殺傷CEA靶細(xì)胞，且兩者對(duì)CEA靶細(xì)胞的殺傷率無(wú)顯著性差別，表明SW480總RNA群中的CEARNA足夠激發(fā)CEA特異性的細(xì)胞毒效應(yīng)。結(jié)果還表明轉(zhuǎn)染SW480總RNA的DC能特異性殺傷SW480靶細(xì)胞，即其能夠產(chǎn)生腫瘤特異性的CTL，雖然負(fù)載CEA的DC誘導(dǎo)的CTL也能特異性殺傷SW480靶細(xì)胞，但其殺傷率顯著低于SW480－CTL的殺傷率。這一結(jié)果又與以下假設(shè)相符，即SW480細(xì)胞中除了CEA蛋白外，還有許多其他未知的腫瘤抗原刺激T細(xì)胞反應(yīng)，而負(fù)載CEA的DC僅能誘導(dǎo)CEA特異性的T細(xì)胞反應(yīng)。因此，用結(jié)腸細(xì)胞總RNA負(fù)載DC可以作為一種新型結(jié)腸癌免疫治療策略，誘導(dǎo)針對(duì)更多未知腫瘤抗原的更全面的抗腫瘤效應(yīng)。

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