王 艷 王艷杰 宋少江 柳 春 趙丹玉

(遼寧中醫(yī)藥大學生物化學與分子生物學教研室，遼寧 沈陽 110847)

在老年性癡呆中，阿爾茨海默病(AD)占多數(shù)。中醫(yī)學認為“濁毒”在AD發(fā)病中具有重要作用，清熱解毒藥物在改善認知功能方面的應(yīng)用已受到重視，如黃連、澤瀉、桅子、白花蛇舌草、夏枯草等藥物，已經(jīng)越來越多的用于改善記憶功能〔1〕。知母屬清熱瀉火藥，具有清熱瀉火，生津潤燥之功效。近年來，體外實驗證明知母皂苷對于學習記憶障礙的小鼠具有一定的治療作用〔2〕。本研究旨在探討知母總皂苷對β－淀粉樣蛋白(Aβ)誘導PC12細胞凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 大鼠PC12細胞，高分化，購于中國科學院上海生命科學研究所生化與細胞所。

1.2 藥物和化學試劑 知母總皂苷，由沈陽藥科大學提供，其純度大于85%;Aβ25～35購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;MTT購于美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗、胰酶購于Hyclone公司;胎牛血清為北京圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;凱基Annexin V－EGFP細胞凋亡檢測試劑盒。

1.3 實驗儀器 Thermo Scientific Forma SeriesⅡ水套CO2培養(yǎng)箱;HFsafe－1200生物安全柜;Leica DFC320倒置相差顯微鏡;BD FAcscalibur流式細胞儀;BIO－RAD iMark酶標儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 Aβ25～35的老化 將5 mg的 Aβ25～35(分子量是1 060.3)溶解于2 357.8 μl的滅菌水中，配制成2 mmol/L的母液，分裝，在37℃孵育96 h后，－20℃保存待用。同時孵育不含Aβ25～35的滅菌水96 h，作為陰性對照組使用。

1.4.2 藥物配制 取知母總皂苷40 mg，加1 ml的滅菌水混勻使其溶解，配制成40 g/L的母液并分裝。工作液濃度分別為0.05，0.25，0.5，2.5，5，10，15，20 mg/L。MTT 液用 PBS 配制，使用濃度為5 g/L。

1.4.3 細胞培養(yǎng) 將PC12細胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)在含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.4.4 Aβ25～35的損傷模型構(gòu)建及MTT法測定其活力 對數(shù)生長期的PC12細胞，以1.5×105/ml的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng) 24 h 后加入不同終濃度為 10、20、30、40 μmol/L的Aβ25～35，每組6復(fù)孔;并設(shè)立相應(yīng)的陰性對照組，即加入與20 μmol/LAβ25～35相同量的孵育 4 d 的滅菌水，24、36、48、72 h后，倒置熒光顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化。每孔加入20 μl MTT繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)基并加入DMSO 150 μl，37℃振蕩10～15 min，酶標儀測定490 nm的吸光度值(OD490)，計算抑制率。

1.4.5 MTT法測知母總皂苷的保護作用 對數(shù)生長期的PC12細胞，以1.5×105/ml的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度的知母總皂苷 0.05，0.25，0.5，2.5，5，10，15，20 mg/L，每組6 復(fù)孔，再加入20 μmol/L 的 Aβ25～35，48 h后倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。MTT法和抑制率的計算方法同上。

1.4.6 流式細胞技術(shù)檢測凋亡率 據(jù)前期結(jié)果，選用0.5 mg/L知母總皂苷和 20 μmol/L Aβ25～35作用 PC12 細胞 48 h條件用于實驗，分為空白組、正常組、模型組、知母治療組。對數(shù)生長期的 PC12細胞，以3×105/ml的濃度500 μl接種于24孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后分別加入上述藥物刺激48 h。用不含EDTA的胰酶消化細胞，每個組有兩個復(fù)孔，重復(fù)3次，用PBS洗滌細胞兩次(1 000 r/min離心5 min)，加入 500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μl Annexin V－EGFP 混勻后，避光10 min，加入5 μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。

1.4.7 Annexin V－EGFP/PI雙染色后形態(tài)觀察 取24孔板，加入多聚賴氨酸處理過的蓋玻片，以1.5×105/ml的濃度500 μl接種對數(shù)生長期的 PC12細胞，培養(yǎng)24 h后分別加入上述藥物刺激48 h。將蓋玻片用PBS洗滌2 min×3次，4%的多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌2 min×3 次，500 μl Binding Buffer中加入 5 μl Annexin V－EGFP，5 μl Propidium Iodide 混勻;將該溶液滴加在蓋玻片表面均勻覆蓋;避光室溫反應(yīng)5～15 min;將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下雙色濾光片觀察，Annexin V－EGFP熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組數(shù)據(jù)均用±s表示，進行單因素方差分析，兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 Aβ25～35對PC12細胞影響的時效量效關(guān)系 終濃度分別為10，20，30，40 μmol/L 的 Aβ25～35與 PC12 細胞作用 24，36，48，72 h后，與常規(guī)培養(yǎng)基比較MTT法測定的吸光度值均明顯降低，且隨著 Aβ25～35濃度增加，吸光度值降低趨勢越明顯，即Aβ25～35有明顯劑量依賴性地抑制細胞活力的作用。在48 h時抑制率是最高的，培養(yǎng)時間延長到72 h，其抑制率反而下降(見表1)。為提高實驗時效，本課題后續(xù)實驗采用20 μmol/L的Aβ25～35作用PC12細胞48 h制備AD細胞模型。

表1 不同濃度的Aβ25～35誘導分化PC12細胞在不同時間段的抑制率(±s，%，n=6)

表1 不同濃度的Aβ25～35誘導分化PC12細胞在不同時間段的抑制率(±s，%，n=6)

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2.2 Aβ25～35刺激后細胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡觀察，正常組細胞密集，細胞間連接緊密，細胞周圍有光圈，有立體感。在Aβ25～35作用下，細胞突觸變短，貼壁性差，細胞間連接較松，細胞碎片較多，胞質(zhì)較暗淡，部分發(fā)生皺縮，胞漿中有較多顆粒。Aβ25～35濃度越大時間越長細胞的狀態(tài)越差。72 h的細胞數(shù)目明顯太多，突觸變短，細胞圓潤性變差。

2.3 不同濃度的知母總皂苷對Aβ25～35誘導PC12細胞的影響倒置顯微鏡下觀察，在知母總皂苷的影響下，細胞突觸相對模型組變長，在低濃度時變化不大，在中間濃度時觀察到細胞碎片變少，細胞光圈變明顯，在高濃度時細胞碎片反而增多，變圓細胞的數(shù)目增多。用不同濃度的知母總皂苷保護，0.05、0.25、0.5、2.5、5、10、15、20mg/L知母組細胞抑制率分別是: (22.193±7.386)%、 (4.886±5.729)%、(21.501±6.497)%、 (24.415±6.440)%、 (22.344±5.004)%、 (20.941±8.489)%、 (47.249±4.227)%，0.05 mg/L濃度和模型組沒有顯著性差異 〔(41.240±5.798)%〕，從0.25 mg/L開始和模型組有了顯著性差異，在0.5 mg/L濃度時其抑制率達到最小，與模型組有顯著性差異(P＜0.01)，在20 mg/L濃度時抑制率大于模型組。故在后期實驗中就采用0.5 mg/L濃度的知母總皂苷。

2.4 知母總皂苷對Aβ25～35誘導PC12細胞凋亡率的影響0.5 mg/L 知母總皂苷和20 μmol/L Aβ25～35共同孵育 PC12 細胞48h，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復(fù)三次。根據(jù)流式細胞儀檢測的結(jié)果，其右上象限為晚期凋亡，右下象限為早期凋亡，本實驗取的是凋亡總值，即右上象限+右下象限。正常組的細胞凋亡率是 (16.65±2.31)%，模型組凋亡率是(36.86±3.94)%，較正常組明顯升高 (P＜0.01)。而知母治療組凋亡率是 (24.65±1.36)%，較模型組明顯減少 (P＜0.01)。

2.5 知母總皂苷對Aβ25～35誘導的PC12細胞凋亡影響的熒光染色 熒光顯微鏡下觀察正常細胞，雖然細胞鋪板密度較大，但染色的很少。模型組出現(xiàn)明顯的凋亡的特點，晚期凋亡較多，即細胞核和細胞膜同時染色，而且細胞核濃染或顆粒狀熒光團塊較多。治療組主要較多出現(xiàn)早期凋亡的特點，即細胞膜被染成了綠色，而細胞核染色的數(shù)目較模型組少，晚期凋亡的特點相對較少 (見圖1)。

圖1 熒光顯微鏡觀察Annexin V-EGFP/PI雙染色后凋亡細胞 (200×)

3 討論

阿爾茨海默病是一種好發(fā)于老年期的以進行性癡呆為主要表現(xiàn)的全腦萎縮性病變，屬中醫(yī)“健忘”、 “癡呆”、 “呆病”范疇〔3〕。古代醫(yī)家多認為，本病因年老體衰，腎精虧虛，精血內(nèi)耗，腦失所養(yǎng)，諸竅失聰所致〔4〕。隨著王永炎院士“濁毒”的提出，結(jié)合現(xiàn)代研究，現(xiàn)代人總結(jié)出虛、疲、濁、毒是導致衰老和AD的主要病因病機，其病位在腦，病因病機不離虛實兩端，本虛標實兼挾多見。脾腎兩虛為其本，淤、濁、毒為其標。淤血、痰濁、毒邪既是臟氣虛衰的結(jié)果，又是主要的致病因素，虛與淤血、濁、毒相互影響，交互為患，成為AD復(fù)雜的病機〔5〕?？梢姖岫臼茿D發(fā)病中的主要致病因素之一，清熱解毒藥物在改善認知功能方面的應(yīng)用已受到重視，如黃連、澤瀉、桅子、白花蛇舌草、金銀花、蔓荊子、夏枯草等藥物，已經(jīng)越來越多的用于記憶功能〔1〕。

研究發(fā)現(xiàn)AD其特征性病理改變?yōu)槟X神經(jīng)細胞外出現(xiàn)Aβ聚集形成的老年斑 (SP)、腦神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白異常聚集形成的纖維纏結(jié) (NFT)、腦皮質(zhì)細胞有不同程度的減少以及星形膠質(zhì)細胞的增生及肥大，最終導致神經(jīng)元死亡〔6〕。本實驗進一步指明了Aβ25～35具有神經(jīng)毒性作用，成功地建立了AD的體外細胞模型。

知母屬清熱下火藥，其性寒，味苦、甘;入肺、腎、胃經(jīng);具有清熱瀉火，生津潤燥之功效。臨床用于外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘等。知母根莖中含有大量甾體皂苷、雙苯吡酮類、木脂索類、多糖類、有機酸類、大量黏液質(zhì)及微量元索等成分〔7〕。其中皂苷為知母的主要成分在根莖中含約6%，且種類較多?，F(xiàn)代研究證明，在大鼠體內(nèi)知母皂苷能促進腦內(nèi)M受體的形成，提高腦源性神經(jīng)生長因子，改善癡呆模型大鼠的學習記憶效果等作用〔2〕。關(guān)于體內(nèi)知母總皂苷對于 Aβ25～35誘導的 PC12凋亡是否有保護作用，國內(nèi)外罕見報道。本研究顯示知母總皂苷能顯著的降低Aβ25～35誘導的PC12模型的凋亡率，其具體機制有待進一步研究。

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3 丁向東，張沁園，孫強三，等.升黃益智顆粒治療阿爾茨海默病的臨床研究〔J〕. 中國老年學雜志，2009;29(8):2023－4.

4 田靜峰，李俊德.中醫(yī)藥治療老年期癡呆探討〔J〕.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009;4(3):214－5，217.

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6 董麗華，胡國華.阿爾茨海默病的蛋白質(zhì)組學研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2004，24(4):377－8.

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