趙利軍，門秀麗，李宏杰，孔小燕，吳 靜，劉麗華

(河北聯(lián)合大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學教研室，河北 唐山 063000)

肢體缺血再灌注(limb ischemia－reperfusion，LIR)損傷是一個全身性的病理過程，?？衫奂靶摹⒛X、肺等遠隔器官[1]。調(diào)動機體內(nèi)源性保護機制，減輕損傷程度，即預(yù)適應(yīng)，是目前再灌注損傷研究領(lǐng)域的討論熱點。在眾多預(yù)適應(yīng)措施中，缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning，IPostC)因其可操作性方面的優(yōu)勢，逐漸受到人們的重視。IPostC可通過抗氧化酶的激活、抑制炎癥反應(yīng)等啟動細胞保護通路[2]。此外，目前關(guān)于IPostC器官保護作用的研究多是針對缺血器官本身而言的，臨床可行性會受到一定的限制。本研究借鑒缺血后適應(yīng)的處理方法，觀察發(fā)生在肢體的IPostC對遠隔組織——心肌的保護效應(yīng)。

材料和方法

1 動物與分組

健康SPF級雄性Wistar大鼠24只，體重200～250 g，購自河南醫(yī)科大學實驗動物中心。動物術(shù)前24 h禁食，飲水自由。動物隨機分為3組(每組8只):正常對照組(C組)、缺血再灌注組(IR組)和缺血再灌注+缺血后適應(yīng)組(IR+IPostC組)。

2 動物模型制備及標本采集

復(fù)制大鼠LIR模型[1]，使用標準化彈性的橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部阻斷血流4 h，然后松解橡皮帶恢復(fù)血流灌注4 h。C組動物松弛結(jié)扎雙后肢不阻斷血流，IR+IPostC組在4 h缺血后，松解肢體恢復(fù)血流灌注5 min，再缺血5 min，反復(fù)5次進行缺血后適應(yīng)，然后再進入4 h血流再灌注階段。實驗結(jié)束時自腹主動脈取血，4℃、3500 r/min離心15 min留取血漿，生化測定待用。取心肌組織100 mg，加入1 mL冷生理鹽水，冰浴條件下電動勻漿3 min制備10%心肌組織勻漿，3500 r/min低溫離心15 min留取上清液，進行心肌組織各項生化指標檢測。每組隨機取2只大鼠，在取血結(jié)束后，迅速在心臟左室游離壁處取材，將取下的組織塊立即投入冷的4%戊二醛－磷酸緩沖液，切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊預(yù)固定，后轉(zhuǎn)入2.5%戊二醛中固定，經(jīng)丙酮脫水、環(huán)氧樹脂618包埋、超薄切片、染色后在透射電鏡下觀察心肌組織的超微結(jié)構(gòu)。

3 試劑、設(shè)備來源及指標測定

心肌組織勻漿及血清制備應(yīng)用FSH－II型高速電動勻漿器(江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠)和SIGMA－2M/ETM低溫高速離心機(Sigma)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測定采用生化試劑盒(購自南京建成生物制品公司)，操作步驟嚴格依照試劑盒說明書進行。速率法測定血清心肌肌鈣蛋白I(myocardial troponin I，cTnI)含量，應(yīng)用肌鈣蛋白膠乳增強免疫比濁定量測定試劑盒(太原市川至生物工程有限公司)進行。血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)及其MB同工酶(creatine kinase MB，CK－MB)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和α－羥丁酸脫氫酶(α－h(huán)ydroxybutyrate dehydrogenase，α－HBDH)測定應(yīng)用7150型全自動生化分析儀(Hitachi)進行。組織超微結(jié)構(gòu)觀察應(yīng)用JEM－100CX透射電子顯微鏡(JEOL Ltd.)。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 心肌損傷的生化指標檢測結(jié)果

與C組比較，再灌注后血清CK、CK－MB和cTnI均升高(P＜0.05)。IR+IPostC組與IR組比較，血清CK、CK－MB和cTnI都有所降低(P＜0.05)，見表1。再灌注后，血清AST、LDH和α－HBDH水平均較C組升高(P＜0.05)。IR+IPostC組與IR組比較，血清AST、LDH和α－HBDH都有所降低(P ＜0.05)，見表1。

表1 各組動物血清CK、CK－MB、cTnI、AST、LDH和α－HBDH的變化Table1.The serum levels of CK，CK－MB，cTnI，AST，LDH and α－HBDH in different groups(.n=8)

表1 各組動物血清CK、CK－MB、cTnI、AST、LDH和α－HBDH的變化Table1.The serum levels of CK，CK－MB，cTnI，AST，LDH and α－HBDH in different groups(.n=8)

#P ＜0.05 vs C group;▲P ＜0.05 vs IR group.

Group CK(103U/L) CK－MB(103U/L) cTnI(μg/L) AST(103U/L) LDH(103U/L) α－HBDH(103U/L)C 0.42 ±0.06 0.55 ±0.12 0.38 ±0.06 0.480 ±0.0600.490 ±0.120 0.600 ±0.110 IR 15.37 ±1.67# 19.12 ±2.48# 3.32 ±0.79# 1.837 ±0.670# 3.856 ±0.480# 4.220 ±0.730#IR+IPostC 8.78 ±1.56#▲ 10.58 ±0.73#▲ 1.14 ±0.09#▲ 0.953 ±0.260#▲ 1.058 ±0.410#▲ 2.138 ±0.500#▲

2 氧化應(yīng)激各項指標的檢測結(jié)果

2.1 血漿SOD、XOD活性和MDA水平 與C組比較，再灌注后血漿XOD活性和MDA水平升高，而SOD活性下降(P＜0.05)，但IR+IPostC組與IR組比較，血漿XOD活性和MDA水平有所降低而SOD活性有所回升(P＜0.05)，見表2。

2.2 心肌組織SOD、MDA和MPO水平 與C組比較，再灌注后心肌組織MPO活性和MDA水平升高，而SOD活性下降(P＜0.05)，但IR+IPostC組與IR組比較，心肌組織MPO活性和MDA水平有所降低而SOD活性有所回升(P＜0.05)，見表3。

3 心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化

電鏡下可見C組心肌肌原纖維排列整齊，明暗帶清晰，線粒體基質(zhì)致密，嵴排列緊密整齊，糖原顆粒豐富，見圖1A。IR組可見肌絲排列紊亂或消失，基質(zhì)明顯水腫，線粒體大部分或全部的嵴和膜融合或消失，空泡化明顯，糖原數(shù)量明顯減少，見圖1B。IR+IPostC組心肌上述病理改變有所減輕，見圖1C。

表2 血漿SOD、XOD和MDA水平Table2.The plasma levels of SOD，XOD and MDA in different groups(.n=8)

表2 血漿SOD、XOD和MDA水平Table2.The plasma levels of SOD，XOD and MDA in different groups(.n=8)

#P ＜0.05 vs C group;▲P ＜0.05 vs IR group.

Group SOD(103U/L) XOD(U/L) MDA(μmol/L)C 75.678 ±19.614 34.030 ±1.652 6.500 ±1.095 IR 7.832 ±1.679# 52.980 ±9.358# 38.595 ±15.551#IR+IPostC 54.341 ±9.091#▲ 35.142 ±1.823#▲ 7.119 ±1.067#▲

表3 心肌組織SOD、MPO和MDA水平Table3.The levels of SOD，MPO and MDA in myocardial tissues of different groups(.n=8)

表3 心肌組織SOD、MPO和MDA水平Table3.The levels of SOD，MPO and MDA in myocardial tissues of different groups(.n=8)

#P ＜0.05 vs C group;▲P ＜0.05 vs IR group.

Group SOD[103U/g protein]MDA[μmol/(g protein)]MPO(U/g)C 48.353±13.067 0.226±0.090 0.424±0.076 IR 19.090±10.355# 0.514±0.098# 0.717±0.069#IR+IPostC 27.031±11.921#▲ 0.452±0.071#▲ 0.591±0.037#▲

Figure1.Myocardial tissue ultrastructure in the three groups(×5000).A:C group;B:IR group;C:IR+IPostC group.圖1 心肌組織超微結(jié)構(gòu)

討 論

近年來，減輕再灌注損傷的各種適應(yīng)機制和措施受到人們的普遍重視。由于組織缺血的發(fā)生往往無法提前預(yù)知，所以曾備受關(guān)注的缺血預(yù)適應(yīng)的臨床應(yīng)用受到很大限制。與預(yù)適應(yīng)相對應(yīng)，IPostC是在長時間組織器官缺血后，先進行短暫的重復(fù)性血管開通及再閉，然后再實施持續(xù)性復(fù)灌[3]。IPostC中多種細胞外信號可通過G蛋白偶聯(lián)受體啟動細胞內(nèi)再灌注損傷補救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)通路，從而激活多種細胞內(nèi)保護性蛋白，有廣泛的全身組織保護作用[4]。

缺血再灌注損傷是多因素參與、非抗原依賴性的全身炎癥反應(yīng)過程。我們以前的研究證實，LIR有遠隔器官損傷作用，可引發(fā)心功能的障礙和心肌組織的損傷等[1]。CK是主要分布在骨骼肌和心肌細胞的胞漿酶，而CK－MB在心肌細胞中含量最多，本實驗中對CK和CK－MB的同步觀察可排除骨骼肌損傷對心肌酶學指標的干擾。cTnI比CK－MB更具有心肌特異性和靈敏性，是目前最理想的心肌細胞損傷標志物[5]。本實驗發(fā)現(xiàn)，LIR后心肌細胞胞漿酶CK和CK－MB釋放增加，且血中cTnI水平上升，同時觀察到心肌細胞肌絲排列紊亂或消失，基質(zhì)明顯水腫，線粒體大部分或全部的嵴和膜融合或消失，空泡化明顯，糖原數(shù)量明顯減少。IPostC組心肌細胞胞漿酶漏出減少，說明IPostC可通過一定機制穩(wěn)定心肌細胞膜的結(jié)構(gòu)。組織MPO的活性可表示組織中PMN的數(shù)量和炎癥損傷的程度。LIR后心肌組織MPO活性升高說明心肌組織中PMN增多，而IPostC可抑制PMN的活化和聚集，組織MPO活性降低。LIR后血液和心肌組織中SOD和MDA的變化提示我們，IPostC有抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)和減輕心肌氧化損傷的作用。

在肢體反復(fù)多次的缺血－再灌注過程中，血液中內(nèi)皮源性緩激肽、前列腺素I2(prostaglandin I2，PGI2)、一氧化氮(nitric oxide，NO)等可作為IPostC遠隔細胞保護作用的觸發(fā)器，激活細胞內(nèi)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)等，促進終效應(yīng)蛋白熱休克蛋白(heat－shock protein，HSP)或ATP敏感性K+(KATP)通道磷酸化[6]。HSP控制肌動蛋白絲聚合，保證細胞骨架的完整。質(zhì)膜KATP通道的開放，通過使動作電位3期復(fù)級加速而縮短動作電位時程和發(fā)生超極化，發(fā)揮心肌保護作用。此外，Sun等[7]在研究HSP72過度表達對心肌的保護作用時，檢測到了錳超氧化物歧化酶(Mn－SOD)的表達增加。本實驗中，血液和心肌組織中的SOD因再灌注引發(fā)的過氧化狀態(tài)而過度消耗，而在IR+IPostC組，觀察到了其活性的增加，與Sun等[7]的報道一致。SOD的表達增強，對自由基的清除作用加強，可能是IPostC發(fā)揮細胞保護作用的機制之一。關(guān)于肢體IPostC對遠位器官保護作用的具體分子生物學機制，有待于進一步深入研究。

[1]趙利軍，門秀麗，董淑云，等.L－精氨酸對大鼠肢體缺血再灌注后心肌損傷的影響[J].中國藥理學通報，2008，24(6):827 －830.

[2]Zhang Y，Leng YF，Xue X，et al.Effects of penehyclidine hydrochloride in small intestinal damage caused by limb ischemia － reperfusion[J].World J Gastroenterol，2011，17(2):254－259.

[3]王 茜，鄧鳳君，林煥冰，等.cAMP信號分子在缺血后適應(yīng)心肌保護機制中的作用[J].中國病理生理雜志，2011，27(8):1496 －1501.

[4]Skyschally A，Schulz R，Heusch G.Pathophysiology of myocardial infarction:protection by ischemia pre－and postconditioning[J].Herz，2008，33(2):88 －100.

[5]Men X，Han S，Gao J，et al.Taurine protects against lung damage following limb ischemia reperfusion in the rat by attenuating endoplasmic reticulum stress－induced apoptosis[J].Acta Orthop，2010，81(2):263 －267.

[6]Zhang QL，Sun YB，Bai B，et al.Effects of Salvia miltiorrhiza Bge.f.alba on neuronal regeneration following cerebral ischemia/reperfusion[J].Neural Regen Res，2010，5(14):1066－1070.

[7]Sun H，Guo T，Liu L，et al.Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after acute myocardial infarction in pigs[J].Heart Surg Forum，2010，13(5):E305 － E310.