趙利軍，門秀麗，李宏杰，孔小燕，吳 靜，劉麗華

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 唐山 063000)

肢體缺血再灌注(limb ischemia－reperfusion，LIR)損傷是一個(gè)全身性的病理過(guò)程，?？衫奂靶摹⒛X、肺等遠(yuǎn)隔器官[1]。調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，減輕損傷程度，即預(yù)適應(yīng)，是目前再灌注損傷研究領(lǐng)域的討論熱點(diǎn)。在眾多預(yù)適應(yīng)措施中，缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning，IPostC)因其可操作性方面的優(yōu)勢(shì)，逐漸受到人們的重視。IPostC可通過(guò)抗氧化酶的激活、抑制炎癥反應(yīng)等啟動(dòng)細(xì)胞保護(hù)通路[2]。此外，目前關(guān)于IPostC器官保護(hù)作用的研究多是針對(duì)缺血器官本身而言的，臨床可行性會(huì)受到一定的限制。本研究借鑒缺血后適應(yīng)的處理方法，觀察發(fā)生在肢體的IPostC對(duì)遠(yuǎn)隔組織——心肌的保護(hù)效應(yīng)。

材料和方法

1 動(dòng)物與分組

健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠24只，體重200～250 g，購(gòu)自河南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物術(shù)前24 h禁食，飲水自由。動(dòng)物隨機(jī)分為3組(每組8只):正常對(duì)照組(C組)、缺血再灌注組(IR組)和缺血再灌注+缺血后適應(yīng)組(IR+IPostC組)。

2 動(dòng)物模型制備及標(biāo)本采集

復(fù)制大鼠LIR模型[1]，使用標(biāo)準(zhǔn)化彈性的橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部阻斷血流4 h，然后松解橡皮帶恢復(fù)血流灌注4 h。C組動(dòng)物松弛結(jié)扎雙后肢不阻斷血流，IR+IPostC組在4 h缺血后，松解肢體恢復(fù)血流灌注5 min，再缺血5 min，反復(fù)5次進(jìn)行缺血后適應(yīng)，然后再進(jìn)入4 h血流再灌注階段。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)自腹主動(dòng)脈取血，4℃、3500 r/min離心15 min留取血漿，生化測(cè)定待用。取心肌組織100 mg，加入1 mL冷生理鹽水，冰浴條件下電動(dòng)勻漿3 min制備10%心肌組織勻漿，3500 r/min低溫離心15 min留取上清液，進(jìn)行心肌組織各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)。每組隨機(jī)取2只大鼠，在取血結(jié)束后，迅速在心臟左室游離壁處取材，將取下的組織塊立即投入冷的4%戊二醛－磷酸緩沖液，切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊預(yù)固定，后轉(zhuǎn)入2.5%戊二醛中固定，經(jīng)丙酮脫水、環(huán)氧樹(shù)脂618包埋、超薄切片、染色后在透射電鏡下觀察心肌組織的超微結(jié)構(gòu)。

3 試劑、設(shè)備來(lái)源及指標(biāo)測(cè)定

心肌組織勻漿及血清制備應(yīng)用FSH－II型高速電動(dòng)勻漿器(江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)和SIGMA－2M/ETM低溫高速離心機(jī)(Sigma)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測(cè)定采用生化試劑盒(購(gòu)自南京建成生物制品公司)，操作步驟嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。速率法測(cè)定血清心肌肌鈣蛋白I(myocardial troponin I，cTnI)含量，應(yīng)用肌鈣蛋白膠乳增強(qiáng)免疫比濁定量測(cè)定試劑盒(太原市川至生物工程有限公司)進(jìn)行。血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)及其MB同工酶(creatine kinase MB，CK－MB)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和α－羥丁酸脫氫酶(α－h(huán)ydroxybutyrate dehydrogenase，α－HBDH)測(cè)定應(yīng)用7150型全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi)進(jìn)行。組織超微結(jié)構(gòu)觀察應(yīng)用JEM－100CX透射電子顯微鏡(JEOL Ltd.)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心肌損傷的生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與C組比較，再灌注后血清CK、CK－MB和cTnI均升高(P＜0.05)。IR+IPostC組與IR組比較，血清CK、CK－MB和cTnI都有所降低(P＜0.05)，見(jiàn)表1。再灌注后，血清AST、LDH和α－HBDH水平均較C組升高(P＜0.05)。IR+IPostC組與IR組比較，血清AST、LDH和α－HBDH都有所降低(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組動(dòng)物血清CK、CK－MB、cTnI、AST、LDH和α－HBDH的變化Table1.The serum levels of CK，CK－MB，cTnI，AST，LDH and α－HBDH in different groups(.n=8)

表1 各組動(dòng)物血清CK、CK－MB、cTnI、AST、LDH和α－HBDH的變化Table1.The serum levels of CK，CK－MB，cTnI，AST，LDH and α－HBDH in different groups(.n=8)

#P ＜0.05 vs C group;▲P ＜0.05 vs IR group.

Group CK(103U/L) CK－MB(103U/L) cTnI(μg/L) AST(103U/L) LDH(103U/L) α－HBDH(103U/L)C 0.42 ±0.06 0.55 ±0.12 0.38 ±0.06 0.480 ±0.0600.490 ±0.120 0.600 ±0.110 IR 15.37 ±1.67# 19.12 ±2.48# 3.32 ±0.79# 1.837 ±0.670# 3.856 ±0.480# 4.220 ±0.730#IR+IPostC 8.78 ±1.56#▲ 10.58 ±0.73#▲ 1.14 ±0.09#▲ 0.953 ±0.260#▲ 1.058 ±0.410#▲ 2.138 ±0.500#▲

2 氧化應(yīng)激各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

2.1 血漿SOD、XOD活性和MDA水平 與C組比較，再灌注后血漿XOD活性和MDA水平升高，而SOD活性下降(P＜0.05)，但I(xiàn)R+IPostC組與IR組比較，血漿XOD活性和MDA水平有所降低而SOD活性有所回升(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.2 心肌組織SOD、MDA和MPO水平 與C組比較，再灌注后心肌組織MPO活性和MDA水平升高，而SOD活性下降(P＜0.05)，但I(xiàn)R+IPostC組與IR組比較，心肌組織MPO活性和MDA水平有所降低而SOD活性有所回升(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

3 心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化

電鏡下可見(jiàn)C組心肌肌原纖維排列整齊，明暗帶清晰，線粒體基質(zhì)致密，嵴排列緊密整齊，糖原顆粒豐富，見(jiàn)圖1A。IR組可見(jiàn)肌絲排列紊亂或消失，基質(zhì)明顯水腫，線粒體大部分或全部的嵴和膜融合或消失，空泡化明顯，糖原數(shù)量明顯減少，見(jiàn)圖1B。IR+IPostC組心肌上述病理改變有所減輕，見(jiàn)圖1C。

表2 血漿SOD、XOD和MDA水平Table2.The plasma levels of SOD，XOD and MDA in different groups(.n=8)

表2 血漿SOD、XOD和MDA水平Table2.The plasma levels of SOD，XOD and MDA in different groups(.n=8)

#P ＜0.05 vs C group;▲P ＜0.05 vs IR group.

Group SOD(103U/L) XOD(U/L) MDA(μmol/L)C 75.678 ±19.614 34.030 ±1.652 6.500 ±1.095 IR 7.832 ±1.679# 52.980 ±9.358# 38.595 ±15.551#IR+IPostC 54.341 ±9.091#▲ 35.142 ±1.823#▲ 7.119 ±1.067#▲

表3 心肌組織SOD、MPO和MDA水平Table3.The levels of SOD，MPO and MDA in myocardial tissues of different groups(.n=8)

表3 心肌組織SOD、MPO和MDA水平Table3.The levels of SOD，MPO and MDA in myocardial tissues of different groups(.n=8)

#P ＜0.05 vs C group;▲P ＜0.05 vs IR group.

Group SOD[103U/g protein]MDA[μmol/(g protein)]MPO(U/g)C 48.353±13.067 0.226±0.090 0.424±0.076 IR 19.090±10.355# 0.514±0.098# 0.717±0.069#IR+IPostC 27.031±11.921#▲ 0.452±0.071#▲ 0.591±0.037#▲

Figure1.Myocardial tissue ultrastructure in the three groups(×5000).A:C group;B:IR group;C:IR+IPostC group.圖1 心肌組織超微結(jié)構(gòu)

討 論

近年來(lái)，減輕再灌注損傷的各種適應(yīng)機(jī)制和措施受到人們的普遍重視。由于組織缺血的發(fā)生往往無(wú)法提前預(yù)知，所以曾備受關(guān)注的缺血預(yù)適應(yīng)的臨床應(yīng)用受到很大限制。與預(yù)適應(yīng)相對(duì)應(yīng)，IPostC是在長(zhǎng)時(shí)間組織器官缺血后，先進(jìn)行短暫的重復(fù)性血管開(kāi)通及再閉，然后再實(shí)施持續(xù)性復(fù)灌[3]。IPostC中多種細(xì)胞外信號(hào)可通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)再灌注損傷補(bǔ)救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)通路，從而激活多種細(xì)胞內(nèi)保護(hù)性蛋白，有廣泛的全身組織保護(hù)作用[4]。

缺血再灌注損傷是多因素參與、非抗原依賴性的全身炎癥反應(yīng)過(guò)程。我們以前的研究證實(shí)，LIR有遠(yuǎn)隔器官損傷作用，可引發(fā)心功能的障礙和心肌組織的損傷等[1]。CK是主要分布在骨骼肌和心肌細(xì)胞的胞漿酶，而CK－MB在心肌細(xì)胞中含量最多，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)CK和CK－MB的同步觀察可排除骨骼肌損傷對(duì)心肌酶學(xué)指標(biāo)的干擾。cTnI比CK－MB更具有心肌特異性和靈敏性，是目前最理想的心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LIR后心肌細(xì)胞胞漿酶CK和CK－MB釋放增加，且血中cTnI水平上升，同時(shí)觀察到心肌細(xì)胞肌絲排列紊亂或消失，基質(zhì)明顯水腫，線粒體大部分或全部的嵴和膜融合或消失，空泡化明顯，糖原數(shù)量明顯減少。IPostC組心肌細(xì)胞胞漿酶漏出減少，說(shuō)明IPostC可通過(guò)一定機(jī)制穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。組織MPO的活性可表示組織中PMN的數(shù)量和炎癥損傷的程度。LIR后心肌組織MPO活性升高說(shuō)明心肌組織中PMN增多，而IPostC可抑制PMN的活化和聚集，組織MPO活性降低。LIR后血液和心肌組織中SOD和MDA的變化提示我們，IPostC有抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)和減輕心肌氧化損傷的作用。

在肢體反復(fù)多次的缺血－再灌注過(guò)程中，血液中內(nèi)皮源性緩激肽、前列腺素I2(prostaglandin I2，PGI2)、一氧化氮(nitric oxide，NO)等可作為IPostC遠(yuǎn)隔細(xì)胞保護(hù)作用的觸發(fā)器，激活細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)等，促進(jìn)終效應(yīng)蛋白熱休克蛋白(heat－shock protein，HSP)或ATP敏感性K+(KATP)通道磷酸化[6]。HSP控制肌動(dòng)蛋白絲聚合，保證細(xì)胞骨架的完整。質(zhì)膜KATP通道的開(kāi)放，通過(guò)使動(dòng)作電位3期復(fù)級(jí)加速而縮短動(dòng)作電位時(shí)程和發(fā)生超極化，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。此外，Sun等[7]在研究HSP72過(guò)度表達(dá)對(duì)心肌的保護(hù)作用時(shí)，檢測(cè)到了錳超氧化物歧化酶(Mn－SOD)的表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)中，血液和心肌組織中的SOD因再灌注引發(fā)的過(guò)氧化狀態(tài)而過(guò)度消耗，而在IR+IPostC組，觀察到了其活性的增加，與Sun等[7]的報(bào)道一致。SOD的表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)自由基的清除作用加強(qiáng)，可能是IPostC發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制之一。關(guān)于肢體IPostC對(duì)遠(yuǎn)位器官保護(hù)作用的具體分子生物學(xué)機(jī)制，有待于進(jìn)一步深入研究。

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