張 彤，曾憲成，李 華，陳文捷，方天翎，聶常富，陳規(guī)劃△

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝移植中心，廣東 廣州 510630;2增城市人民醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 511300;3廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510120;4鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，河南 鄭州 450003)

人類白細(xì)胞抗原E(human leukocyte antigen E，HLA－E)是功能和作用途徑最為明確的主要非經(jīng)典HLA－I類分子。Malmberg等[1]的一項研究顯示，CD94/NKG2受體能通過上調(diào)HLA－E使腫瘤細(xì)胞免受細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)介導(dǎo)的腫瘤殺傷作用，這可能構(gòu)成了腫瘤免受CTL介導(dǎo)的免疫攻擊的一個機(jī)制。據(jù)報道，HLA－E低表達(dá)于幾乎所有成人細(xì)胞表面，是免疫細(xì)胞[自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞或部分CTL亞群]抑制性CD94/NKG受體的主要配體[2，3]。非經(jīng)典HLA－I分子的發(fā)現(xiàn)，及其特點和功能的進(jìn)一步闡明，解釋了為什么經(jīng)典HLA－I分子“缺失”的癌細(xì)胞逃避了CTL“殺傷”的同時，也逃避了NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視。目前，HLA－E在肝癌細(xì)胞中表達(dá)的研究較少，本課題研究HLA－E在各種肝癌細(xì)胞系和胎肝細(xì)胞系中的表達(dá)情況，明確它在肝癌的腫瘤免疫逃避的功能和作用，為我們的后續(xù)研究提供研究基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗對象 人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞(來源ATCC)、PLC細(xì)胞(來源 ATCC)、Hep3B2.1－7細(xì)胞(來源 ATCC)、Bel7402細(xì)胞以及胎肝正常細(xì)胞系 L02細(xì)胞均購自中科院上海細(xì)胞生物研究所，MHCC97－H(高轉(zhuǎn)移)細(xì)胞購于上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所。

1.2 主要試劑 高糖DMEM粉劑(Gibco)，優(yōu)級胎牛血清(PAA)，胎牛血清(HyClone)，新生牛血清(Gibco)，RNAprep培養(yǎng)細(xì)胞總 RNA提取試劑盒(北京天根)，SYBR Prime-ScriptTMRT －PCR Kit(TaKaRa)，PMSF(上海申能博彩)，細(xì)胞可溶性總蛋白裂解液(lysis buffer)(CST)，BCA蛋白定量試劑盒(深圳晶美生物公司)，小鼠抗人單抗HLA－E和小鼠抗人單抗GAPDH均購自Abcam，Western blotting試劑盒(Pierce)，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgGⅡ抗(Pirece)。引物設(shè)計及合成:HLA－E基因(NM－005516)1701 bp，人類來源，HLA－E上游引物序列 TGTGGTGGTGCCTTCTGG，下游引物序列 GCACTGTCGCTCCACTCA;GAPDH(NM_002046)上游引物序列g(shù)CAACCgTCAAggCTgAgAAC，下游引物序列 TggTgAAgACgCCAgTggA。引物設(shè)計、合成由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MHCC979細(xì)胞使用含10%優(yōu)級胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液;HepG2、Hep3B2.1－7和 PLC細(xì)胞均使用含10%胎牛血清高糖DMEM;Bel7402和L02細(xì)胞均使用含10%新生牛血清高糖DMEM培養(yǎng)。培養(yǎng)基中加入青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)。每2～3 d換液1次，待細(xì)胞長80%融合度時，0.25%胰酶消化傳代。培養(yǎng)條件:在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 Real－time PCR檢測 HLA－E mRNA的表達(dá) 收集上述6組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，按照試劑盒操作手冊提取總RNA，用紫外分光光度法定量RNA。將等量的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈。SYBR PrimeScriptTMRT－PCR Kit(TaKaRa)(兩步法)實驗步驟如下:37℃15 min，85℃ 5 s。將PCR反應(yīng)液加入real－time PCR反應(yīng)管中:95.0℃ 10 s，1個循環(huán);95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃ 31 s，40 個循環(huán)，95.0 ℃15 s，60.0 ℃ 10 s，95.0 ℃15 s，1個循環(huán)。計算 ΔCt值和RQ 值(RQ=2－ΔΔCt)。

2.3 Western blotting檢測HLA－E蛋白的表達(dá) 分別收取6組細(xì)胞，PBS洗3次，細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，按照試劑盒操作手冊提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒對收取的各組蛋白進(jìn)行定量，取等量蛋白30 μg行SDS－PAGE，電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉3 h后加Ⅰ抗(1∶500)放置于4℃過夜，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgGⅡ抗(1∶100000)與膜室溫孵育1 h。PVDF膜曝光60～90 s后膠片放人全自動X片沖洗機(jī)完成顯影、定影和干燥等。Bio－Rad全自動掃描儀掃描膠片，Quantity One軟件分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩個樣本均數(shù)比較應(yīng)用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HLA－E mRNA在肝癌細(xì)胞系及胎肝細(xì)胞系中的表達(dá)

除Hep3B2.1－7細(xì)胞表達(dá)幾乎接近缺失(P＜0.01)外，HLA－E mRNA在各肝癌細(xì)胞系和胎肝細(xì)胞系中的表達(dá)無顯著差異(P ＞0.05)，見圖 1。

Figure1.The HLA－E mRNA expression in hepatocellular carcinoma cell lines and fetal liver cell line(L02).1:L02 cells;2:HepG2 cells;3:Bel7402 cells;4:PLC cells;5:MHCC97 －H cells;6:Hep3B2.1 －7 cells..n=6.△△P＜0.01 vs 1.圖1 HLA－E mRNA在肝癌細(xì)胞系及胎肝細(xì)胞系中的表達(dá)

2 HLA－E蛋白在肝癌細(xì)胞系及胎肝細(xì)胞系中的表達(dá)

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與胎肝細(xì)胞L02相比，在肝癌細(xì)胞系 HepG2、Bel7402、PLC、Hep3B2.1 －7 和 MHCC97－H中HLA－E/GAPDH的吸光度比值顯著差異(P＜0.01)，其中Hep3B2.1－7細(xì)胞表達(dá)缺失，見圖2。

討 論

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompability complex，MHC)，是一組緊密連鎖的高度多態(tài)性基因組成的染色體區(qū)域，其產(chǎn)物表達(dá)在不同的細(xì)胞表面。人類MHC又稱人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)系統(tǒng)。HLA系統(tǒng)是免疫功能相關(guān)基因最集中、密度最高、多態(tài)性最豐富、與疾病關(guān)系最密切的一個區(qū)域。HLA系統(tǒng)分為3類:HLA－I、HLA－Ⅱ和HLA－Ⅲ。HLA－I類基因又根據(jù)編碼產(chǎn)物的組織分布，功能及多態(tài)性不同可分為經(jīng)典MHC－I類(HLA－Ia)和非經(jīng)典MHC－I類(HLA－Ib)基因。

Figure2.HLA－E protein expression in fetal liver cell line(L02)and hepatocellular carcinoma cell lines.1:L02 cells;2:HepG2 cells;3:Bel7402 cells;4:PLC cells;5:MHCC97－H cells;6:Hep3B2.1－7 cells..n=6.△△P＜0.01 vs 1.圖2 Western blotting法檢測胎肝細(xì)胞系及各種肝癌細(xì)胞系中HLA－E蛋白的表達(dá)

HLA－E屬于HLA－Ib類，基因位于染色體區(qū)域6p213，HLA－E和G位點各有4個復(fù)等位基因。HLA－E基因座位是所有已知靈長類I類組織相容性基因最保守的，不同于經(jīng)典分子，非經(jīng)典HLA具有特異性的轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和免疫作用[4]。腫瘤逃避機(jī)體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK)的免疫監(jiān)視，可能與癌細(xì)胞表面經(jīng)典HLA－I(HLA－ABC)下調(diào)或缺失、非經(jīng)典HLA－I(HLA－E)異常高表達(dá)有關(guān)[5－7]。

我們前期研究了40例肝癌肝移植患者的臨床標(biāo)本中HLA－E的表達(dá)情況并進(jìn)行隨訪，部分HLA－E高表達(dá)的患者肝移植后無瘤生存時間縮短，在隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)有所增加，可能是HLA－E直接或間接通過抑制NK和T細(xì)胞，產(chǎn)生利于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的免疫環(huán)境[8，9]。

本研究利用特異性引物PCR反應(yīng)的方法，證實在mRNA水平上，除肝癌細(xì)胞Hep3B2.1－7的HLA－E mRNA表現(xiàn)為幾乎接近缺失，其它各肝癌細(xì)胞系的HLA－E mRNA的拷貝數(shù)與胎肝細(xì)胞L02比較，無明顯差異(P＞0.05)。但是在蛋白表達(dá)水平上，各肝癌細(xì)胞系與胎肝細(xì)胞L02 HLA－E/GAPDH吸光度比值的比較，有顯著差異(P＜0.01)。和胎肝細(xì)胞相比，HLA－E表達(dá)在各種肝癌細(xì)胞系中普遍較低，肝癌細(xì)胞Hep3B2.1－7表達(dá)缺失，Bel7402和 MHCC97表達(dá)很少，HepG2表達(dá)較低，僅PLC細(xì)胞接近L02水平。以上結(jié)果顯示，HLA－E在各種肝癌細(xì)胞系中普遍表達(dá)較低，可能通過介導(dǎo)NK細(xì)胞表面抑制性受體逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。同時，細(xì)胞HLA－E mRNA豐度和蛋白產(chǎn)物存在不一致性，可能存在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[10]。

HLA－E分子在細(xì)胞中及細(xì)胞表面的表達(dá)量相當(dāng)?shù)停赡苁怯捎谌狈m當(dāng)?shù)膬?nèi)源肽與之結(jié)合，致使HLA－E在胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程及細(xì)胞表面表達(dá)均不穩(wěn)定[11]。這也解釋了我們研究中細(xì)胞HLA－E mRNA豐度和蛋白產(chǎn)物存在不一致性，可能存在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[10]。

HLA－E分子在腫瘤細(xì)胞表面的異常表達(dá)，可能是腫瘤細(xì)胞逃避NK細(xì)胞免疫監(jiān)視的一個新機(jī)制。因此，檢測HLA抗原在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)是一個新的指標(biāo)，有助于制定未來的腫瘤生物治療策略。

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