羅 莎，田小菲，周懿舒，李馮銳，朱蘭卉，羅曉光，任 艷，龐 灝△

(1中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110001;2東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024;3河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，河北 張家口 075000;4中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其中65歲以上人群PD患病率為1% ～2%[1]。PD在臨床上表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、步態(tài)異常等;病理改變主要包括中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元缺失，殘存的神經(jīng)元變性，以及Lewy小體在胞漿內(nèi)的出現(xiàn)。目前為止，PD的病因尚不明確，但眾多的研究顯示PD可能與氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂、環(huán)境毒素及遺傳因素等密切相關(guān)。

PD多為散發(fā)病例，其中僅有少數(shù)的患者為家族性。隨著對(duì)PD相關(guān)易感基因的研究，越來越多的證據(jù)表明PD患者中存在著多種遺傳危險(xiǎn)因素。目前，在家族性PD中已經(jīng)確定了約18個(gè)相關(guān)的基因，并分別命名為PARK1～18?？刂乒埠说鞍?α－synuclein)表達(dá)的基因SNCA(也稱為PARK1)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的與PD相關(guān)的致病基因，基因表達(dá)產(chǎn)物在PD發(fā)病過程中發(fā)揮著核心作用[2]。纖維狀共核蛋白是PD患者Lewy小體的主要成分，而且SNCA基因的突變可能與PD病人黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的退行性變有關(guān)。PARK16基因是近來在日本和歐洲群體中進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome－wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的PD易患相關(guān)區(qū)域[3]，在這個(gè)位于人類染色體1q32的區(qū)域中包含SLC45A3、NUCKS1、RAB7L1、SLC41A1 和 PM20D1 等多個(gè) PD候選基因。盡管來自上述2個(gè)PD易感基因中的部分單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)在國內(nèi)外已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道[3－5]，但是這些易感因素與PD的相關(guān)性在中國遼寧地區(qū)群體中尚未有任何相關(guān)數(shù)據(jù)。因此，本研究借助多重PCR－限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment lenth polymorphism，RFLP)技術(shù)，同時(shí)調(diào)查了中國遼寧地區(qū)PD與正常匹配人群中PARK16基因的rs16856139和SNCA基因的rs3857059兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，以期逐步建立中國遼寧地區(qū)PD人群中易感基因的相關(guān)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

材料和方法

1 對(duì)象

中國遼寧地區(qū)漢族人群散發(fā)性PD患者213例，其中男112例，女 101例，平均年齡(62.39 ± 10.60)歲(24～85歲)，所有患者均由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科學(xué)專家依據(jù)英國腦庫PD診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。對(duì)照組為隨機(jī)選擇的健康遼寧地區(qū)漢族個(gè)體，其中男128例，女86例，平均年齡(63.15±10.84)歲(34～84歲)。本研究得到我校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

2 方法

2.1 基因組DNA提取 抽取研究對(duì)象外周靜脈血約3 mL，采用SDS－蛋白酶K－酚氯仿法提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度后，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 多重PCR引物 依據(jù)報(bào)道的SNCA和PARK16的基因組序列，經(jīng) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進(jìn)行特異性比對(duì)，同時(shí)考慮接續(xù)的限制性內(nèi)切酶Pvu II的識(shí)別序列特征，由上海生工合成，引物相關(guān)序列見表1。

表1 rs16856139和rs3857059的引物序列及PCR擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)Table1.Primer sequences and parameters for PCR amplification on rs16856139 and rs3857059 loci

2.3 多重PCR－RFLP及產(chǎn)物檢測(cè) 多重PCR是在一個(gè)20 μL的PCR反應(yīng)體系中，包括1×Es Taq MasterMix(CWBIO，中國北京)，引物濃度均為 0.4 μmol/L，見表 1，50 ～100 ng 的基因組DNA。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán);最后72℃ 1 min。反應(yīng)結(jié)束后，將2 μL PCR產(chǎn)物放入含有2.5 U Pvu II的限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)體系中孵育2 h。酶切產(chǎn)物應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(T=6%，C=5%)，分離后的凝膠應(yīng)用 10×genefinder(Bio－V，中國廈門)染色后，紫外燈下觀察結(jié)果并照相保存。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 13.0和PLINK 1.07(http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)[6]，對(duì) PD 和正常人群組進(jìn)行基因型的Hardy－Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)，對(duì)兩組基因頻率和基因型頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，同時(shí)對(duì)兩組間數(shù)據(jù)的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

1 多重PCR－RFLP法對(duì)2個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型鑒定

PCR－RFLP進(jìn)行基因型鑒定是一個(gè)簡(jiǎn)單的DNA水平分析SNP的方法，合理選擇多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行同步擴(kuò)增，同時(shí)采用單一限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化及接續(xù)的片段長度分析，將是更為有效的SNPs分析手段。本研究選取2種PD易感基因中的2個(gè)SNPs位點(diǎn)為研究對(duì)象，其一的rs3857059位點(diǎn)如為rs3857059＞G，可與其相鄰堿基構(gòu)成限制性內(nèi)切酶Pvu II的識(shí)別序列;而另一個(gè)rs16856139位點(diǎn)的2種等位基因的堿基均不能與鄰近堿基構(gòu)成Pvu II的識(shí)別序列，但是本研究采用錯(cuò)配引物序列后可人為創(chuàng)建出Pvu II的識(shí)別序列。圖1為本研究中采用PCR－RFLP法同步得出的2位點(diǎn)基因型分型圖譜。rs16856139位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物長度為212 bp，Pvu II酶切后仍然為212 bp的一個(gè)片段，為基因型TT;僅見一個(gè)195 bp的片段為CC基因型;同時(shí)見到215和195 bp的2個(gè)片段為CT基因型。rs3857059位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物長度為164 bp，Pvu II酶切后仍然為164 bp的一個(gè)片段，為AA基因型;僅見一個(gè)112 bp的片段為GG基因型;同時(shí)見到164和112 bp的2個(gè)片段為AG基因型(片段大小如表1中所描述，但采用本研究的電泳條件，52 bp以下的片段從陽極側(cè)泳出)。本研究的結(jié)果顯示2個(gè)位點(diǎn)在所有樣品中均可成功擴(kuò)增和進(jìn)行基因型判定。

2 rs3857059和rs16856139位點(diǎn)的基因型頻率分布

應(yīng)用上述分型方法，本研究對(duì)中國遼寧地區(qū)213例PD患者及214例正常個(gè)體的SNCA基因的rs3857059和PARK16基因的rs16856139位點(diǎn)的基因型頻率分布進(jìn)行了調(diào)查，相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)表明PD組與對(duì)照組基因型觀察值與期望值符合Hardy－Weinberg平衡(P＞0.05)。

Figure1.The genotyping map of rs3857059 and rs16856139 loci determined by PCR －RFLP.圖1 rs3857059和rs16856139位點(diǎn)PCR－RFLP的基因型分型圖

表2 中國遼寧地區(qū)PD患者和正常人群中rs16856139和rs3857059位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的分布Table2.Distribution of genotypic and allelic frequencies of rs16856139 and rs3857059 loci in PD patients and control people in Liaoning area of China

比較2個(gè)位點(diǎn)在2個(gè)不同組中基因頻率分布的數(shù)據(jù)顯示，PD組在rs3857059位點(diǎn)上的G等位基因頻率高于對(duì)照組(59.39%vs 49.77%)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.592，P＜ 0.01，OR=0.677，95%CI 0.517 ～0.888);PD 組在rs16856139位點(diǎn)上的T等位基因頻率明顯低于對(duì)照組(4.69%vs 11.21%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.511，P ＜0.01，OR=0.390，95%CI 0.227 ～0.669)，見表 2。此外，本研究也對(duì)rs3857059和rs16856139兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性在性別上的差異進(jìn)行了分析，相關(guān)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)見表3。從表中可以看出，在男性群體中的rs16856139和rs3857059的疾病相關(guān)性較強(qiáng)(P＜0.01和 P＜0.05，OR=0.365和 OR=0.723)，但在女性群體中并不明顯。

討 論

目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PD易感基因的SNPs超過數(shù)百個(gè)，這樣，在不同PD人群中鑒定出密切相關(guān)的易感基因中的SNPs具有重要的臨床意義。近來來自多個(gè)PD的GWAS研究顯示，集中在SNCA、PARK16、LRRK2和BST14個(gè)基因中的SNPs與不同種族的PD患者發(fā)病危險(xiǎn)性相關(guān)[3－4]。SNCA是第一個(gè)鑒定的與PD發(fā)病密切相關(guān)聯(lián)的基因，基因定位在人類染色體4q21－q23上，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。研究表明SNCA具有調(diào)節(jié)突觸的可塑性、整合突觸的前信號(hào)、調(diào)節(jié)突觸處的多巴胺含量、熱休克蛋白樣作用及參與脂代謝調(diào)節(jié)等生理功能[7];病理上，SNCA基因表達(dá)的共核蛋白是Lewy小體的主要成分。這樣，SNCA基因的突變不僅可以導(dǎo)致家族性PD病人黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的退行性變，異常的SNCA堆積也可引起癡呆、阿爾茨海默病、多系統(tǒng)萎縮及共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8]。因此，其基因突變引起PD的研究備受關(guān)注。最早觀察到的SNCA基因中的突變是A53T，之后在歐洲白種人PD家系中又發(fā)現(xiàn)了A30P和E46K，3個(gè)錯(cuò)義突變可解釋部分白人群體中PD家系患病的原因。然而，在我國進(jìn)行的A53T和A30P突變調(diào)查結(jié)果顯示，其不是中國家族性帕金森病的突變熱點(diǎn)，推測(cè)其在東方人群中是罕見的家族性帕金森病致病突變。2003年，蘇敬敬等[9]選擇SNCA基因的第3和第4外顯子中A377T和C243G兩個(gè)編碼區(qū)的SNPs為研究靶點(diǎn)，在散發(fā)性的PD人群中進(jìn)行了發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的調(diào)查，結(jié)果排除了SNCA基因A377T和C243G兩個(gè)位點(diǎn)在散發(fā)性PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中的作用。Zhao等[10]首先在國內(nèi)調(diào)查了共核蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)微衛(wèi)星多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了這個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)與晚發(fā)性散發(fā)性PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。Chang等[11]的GWAS對(duì)中國PD人群SNCA基因的3個(gè)SNPs進(jìn)行了調(diào)查，分別定位在SNCA基因5’側(cè)翼區(qū)、3’側(cè)翼區(qū)和內(nèi)含子序列中SNPs的基因型數(shù)據(jù)顯示，SNCA基因增加了PD患病的危險(xiǎn)性。近來的GWAS在日本人群中的數(shù)據(jù)顯示，SNCA基因區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)與PD相關(guān)的SNPs，其中的rs3857059(P=5.68 ×10－16，OR=1.36)和 rs11931074(P=7.35 × 10－17，OR=1.37)兩個(gè)位點(diǎn)與PD呈顯著相關(guān)[3]。幾乎同時(shí)發(fā)表的歐洲的 GWAS數(shù)據(jù)中，SNCA基因區(qū)域的 rs3857059、rs11931074及rs2736990構(gòu)成白人群體中與PD顯著性相關(guān)的前三位SNPs位點(diǎn)[4]。SNCA基因這些不同地區(qū)和種族表現(xiàn)出的相關(guān)性數(shù)據(jù)，進(jìn)一步證明SNCA在所有群體中為主要的PD患病危險(xiǎn)因子。比較2個(gè)群體中rs3857059位點(diǎn)的數(shù)據(jù)，可發(fā)現(xiàn)同為PD患病危險(xiǎn)相關(guān)位點(diǎn)，但是群體之間的等位基因頻率存在顯著性差異，提示在PD中存在群體特異性遺傳異質(zhì)性。然而，目前對(duì)上述的GWAS水平發(fā)現(xiàn)的SNCA基因中的SNPs在其它群體內(nèi)疾?。瓕?duì)照組相關(guān)性的研究報(bào)道甚少。本研究選擇定位在 SNCA基因內(nèi)含子4中的rs3857059位點(diǎn)進(jìn)行基因多態(tài)性分析，首次在中國群體中發(fā)現(xiàn)G等位基因頻率在PD患者組高于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果符合日本群體中報(bào)導(dǎo)的數(shù)據(jù)，同時(shí)提示與PD發(fā)病遺傳學(xué)上密切相關(guān)的SNCA基因，盡管在中國人群中的編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)致病突變，但是非編碼區(qū)可能存在一定的與PD發(fā)病相關(guān)聯(lián)的SNP，本研究得到的數(shù)據(jù)也為進(jìn)一步系統(tǒng)分析SNCA基因在中國PD人群中的作用提供了有意義的數(shù)據(jù)。

表3 不同性別中rs3857059和rs16856139的等位基因頻率分布Table3.Allelic frequencies of rs16856139 and rs3857059 loci between different sexes

SLC45A3(solute carrier family 45，member 3)是 PARK16區(qū)域中包含的基因之一，最初發(fā)現(xiàn)其與前列腺癌發(fā)病相關(guān)，產(chǎn)物也稱為前列腺相關(guān)蛋白6(PCANAP6)?；虻木幋a區(qū)長1662 bp，含有5個(gè)外顯子。Satake等[3]鑒定的存在于PARK16與 PD相關(guān)的 7個(gè) SNPs，僅 rs16856139存在于SLC45A3基因中，定位在內(nèi)含子1序列內(nèi)。自從GWAS中相關(guān)PARK16的研究顯示日本人群中PD患者與該區(qū)域的部分SNPs密切相關(guān)后，以PARK16為靶點(diǎn)在不同地區(qū)和群體進(jìn)行了廣泛深入的研究。GWAS結(jié)果及不同方法的易感位點(diǎn)復(fù)制實(shí)驗(yàn)研究顯示，在大部分歐洲起源的PD群體與PARK16呈弱相關(guān)[4];在英國和西班牙北部調(diào)查的頻率數(shù)據(jù)顯示與PD不相關(guān)[12－13];智利 PD患者中的基因型與 PARK16基因相關(guān)[14]。相關(guān)的研究近期也在眾多的亞洲群體進(jìn)行了報(bào)道。Chang等[11]調(diào)查了中國四川地區(qū)人群PARK16易感區(qū)域中的4個(gè)SNPs，發(fā)現(xiàn)包括rs16856139位點(diǎn)在內(nèi)的3個(gè)次要基因與PD的低危險(xiǎn)患病相關(guān);來自中國浙江地區(qū)的rs16856139位點(diǎn)數(shù)據(jù)也顯示，其次要等位基因頻率在對(duì)照組明顯高于PD組，暗示了次要基因的保護(hù)性作用[15];日本學(xué)者在PARK16區(qū)域發(fā)現(xiàn)的7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，認(rèn)為其中的rs947211與PD相關(guān)性最強(qiáng)，但rs16856139也表現(xiàn)出為PD相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。然而，Tan等[16]報(bào)道的新加坡華人rs16856139位點(diǎn)數(shù)據(jù)與上述2個(gè)中國大陸地區(qū)的數(shù)據(jù)不同，頻率數(shù)據(jù)在PD與對(duì)照組之間差距不顯著。為了積攢更多的數(shù)據(jù)，同時(shí)也為了解PARK16基因SNPs在中國遼寧地區(qū)人群中分布的特征，本研究也對(duì)SLC45A3基因中的rs16856139位點(diǎn)進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示中國遼寧地區(qū)群體中能夠復(fù)制出日本、中國四川和浙江群體中觀察到的結(jié)果，但是與上述群體中報(bào)道的數(shù)據(jù)比較(如表4所示)，本研究的次要等位基因頻率更低，提示該位點(diǎn)除了存在的高度種族差異性外，可能同樣存在地域差異性。需要指出的是PD患者中PARK16的作用仍然是一個(gè)爭(zhēng)論的焦點(diǎn)，種族起源的不同及樣本大小可能導(dǎo)致了這些差異，但是進(jìn)一步對(duì)SLC45A3基因其它相關(guān)SNPs位點(diǎn)的研究，以及對(duì)PARK16其它基因的SNPs研究將會(huì)為中國遼寧地區(qū)PD群體提供大量有意義的數(shù)據(jù)，也將會(huì)為系統(tǒng)分析這一基因?qū)D的作用提供幫助，同樣也是對(duì)GWAS完成后的接續(xù)復(fù)制研究的進(jìn)一步鑒定。

表4 SLC45A3基因rs16856139位點(diǎn)次要等位基因頻率的比較Table4.Comparison of minor allelic frequencies of rs16856139 locus in SLC45A3 gene

綜上所述，本研究成功應(yīng)用多重PCR－RFLP技術(shù)同時(shí)檢測(cè)了rs3857059和rs16856139的基因多態(tài)性;首次在中國遼寧地區(qū)群體中發(fā)現(xiàn)了這2個(gè)SNPs位點(diǎn)與PD患病的危險(xiǎn)性相關(guān)。本研究將為探討SNCA和PARK16基因在PD發(fā)病中的作用提供有用的數(shù)據(jù)。

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