趙 強(qiáng)，張志偉，劉重元，楊 科，謝 妮，張 婕

(1腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南華大學(xué)腫瘤研究所，2南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，3南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

EB病毒(Epstein－Barr virus，EBV)感染與鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)的發(fā)生密切相關(guān)[1]，其編碼的潛伏膜蛋白 1(latent membrane protein 1，LMP1)是重要的致瘤蛋白[2]。羧基端胞漿區(qū)是LMP1將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)、活化不同信號(hào)通路而發(fā)揮其生物學(xué)功能的重要部位，包含3個(gè)羧基端功能活性區(qū)(carboxyl terminal activating region，CTAR)，即 CTAR1、CTAR2和 CTAR3[3－4]。前期，我們篩選到LMP1調(diào)節(jié)的p27與核糖體磷蛋白大亞基P0(ribosomal phosphoprotein large P0，RPLP0)蛋白[5，12]。為進(jìn)一步了解LMP1與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在組織中表達(dá)相關(guān)性，本文檢測(cè)LMP1調(diào)節(jié)的p27與RPLP0蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，分析蛋白質(zhì)間的相互調(diào)節(jié)規(guī)律及臨床病理學(xué)意義，為揭示EB病毒與鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)資料。

材料和方法

1 材料

收集2009年8月～2010年10月南華大學(xué)附一醫(yī)院的鼻咽上皮組織石蠟塊30例(其中男性18例，女性12例，平均年齡35歲)和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織石蠟塊60例(其中男性41例，女性19例，平均年齡44.5歲)。另外收集鼻咽部活檢新鮮標(biāo)本鼻咽上皮組織和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織各10例，其中LMP1陽(yáng)性組織各5例。

2 免疫組織化學(xué)染色

將制備好的石蠟切片二甲苯脫蠟2次后水化;PBS洗片3次，每次3 min;浸入盛有枸櫞酸鹽緩沖液容器中微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù);加3%過(guò)氧化物酶阻斷液，37℃ 15 min;PBS洗片3次，每次3 min;加足量非免疫性動(dòng)物血清，37℃ 10 min;分別滴加Ⅰ抗(抗LMP1和p27蛋白抗體為福建邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，克隆號(hào)為 CS1－4和 MAB－0242;RPLP0蛋白抗體為Abcam產(chǎn)品，克隆號(hào)為DCS－72.F6)，置濕盒中4℃冰箱過(guò)夜;滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，37℃ 15 min;滴加鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶溶液，37℃ 15 min;DAB顯色、蘇木素復(fù)染、返藍(lán)、脫水、透明，封片，顯微鏡觀察、照相。陽(yáng)性表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn):淺黃色為弱陽(yáng)性，黃色或棕黃色為中等陽(yáng)性，棕色或深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性，無(wú)棕黃色或與背景著色一致為陰性。

3 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

將收集的活檢鼻咽上皮組織與鼻咽癌組織按照LMP1(－)或(+)分別混合，剪碎、裂解、提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，以每孔30 μg總蛋白，經(jīng)10%SDS不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，p27或RPLP0蛋白Ⅰ抗(購(gòu)自Santa Cruz;1∶1000)和Ⅱ抗(購(gòu)自 Santa Cruz;1∶2000)孵育、發(fā)光、曝光、顯影、定影和分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，p27和RPLP0蛋白的表達(dá)采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中LMP1蛋白的表達(dá)

LMP1蛋白表達(dá)于胞膜和胞漿，見(jiàn)圖1，其中鼻咽上皮組織的表達(dá)率為73.3%，而鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中表率為90.0%，見(jiàn)表1，提示正常人群和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者組織中EBV感染率均較高。

Figure1.The positive expression of LMP1 protein in nasopharyngeal epithelial(A)and nasopharyngeal poorlydifferentiated squamous－cell carcinoma(B)tissues(SP，×400).圖1 LMP1蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)

2 鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中p27蛋白的表達(dá)

p27蛋白表達(dá)于細(xì)胞核，見(jiàn)圖2。與LMP1(－)組織相比，p27蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮組織和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)降低，見(jiàn)圖3，提示LMP1抑制鼻咽上皮組織和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中p27蛋白的表達(dá)。

Figure2.The expression of p27 protein in nasopharyngeal epithelial(A，B)and nasopharyngeal poorly－differentiated squamous－cell carcinoma(C，D)tissues(SP，×400).A，C:LMP1 －negative expression;B，D:LMP1 －positive expression.圖2 p27蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

Figure3.The expression of p27 and RPLP0 proteins in nasopharyngeal epithelial(N)and nasopharyngeal poorlydifferentiated squamous－ cell carcinoma(C)tissues.圖3 p27和RPLP0蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

3 鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中RPLP0蛋白的表達(dá)

RPLP0蛋白表達(dá)于胞核和胞漿，見(jiàn)圖4。與LMP1(－)組織比較，RPLP0蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮組織和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)升高，見(jiàn)圖3，提示LMP1促進(jìn)鼻咽上皮組織和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中RPLP0蛋白的表達(dá)。

4 p27和RPLP0蛋白表達(dá)與鼻咽癌臨床病理的關(guān)系

p27和 RPLP0蛋白表達(dá)與鼻咽癌患者年齡、LMP1蛋白的表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P＜0.05)，其中患者年齡小、LMP1蛋白的表達(dá)陰性、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期I和II期時(shí)，p27蛋白表達(dá)陽(yáng)性率相對(duì)較高，而RPLP0蛋白表達(dá)則與之相反(P＜0.05);另外2種蛋白表達(dá)均與患者性別無(wú)關(guān)(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

Figure4.The expression of RPLP0 protein in nasopharyngeal epithelial(A，B)and nasopharyngeal poorly－differentiated squamouscell carcinoma(C，D)tissues(SP，×400).A，C:LMP1－negative expression;B，D:LMP1 －positive expression.圖4 RPLP0蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

表1 p27和RPLP0蛋白表達(dá)在鼻咽癌中的臨床病理學(xué)分析Table1.Clinical pathology analysis of the expression of p27 and RPLP0 proteins in nasopharyngeal poorly－differentiated squamouscell carcinoma tissue

討 論

鼻咽癌是我國(guó)南方地區(qū)如廣東、廣西、湖南和香港等常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生涉及遺傳、EB病毒感染、飲食及地理等諸多因素，是一個(gè)多基因、多途徑和多階段的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，屬多基因遺傳性疾病[1－2]。為揭示EB病毒在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，我們前期選取EB病毒編碼的重要致瘤蛋白LMP1進(jìn)行了相關(guān)研究，采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，篩選獲得包括p27與RPLP0蛋白等在內(nèi)的39個(gè)LMP1調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)[5]。為了進(jìn)一步證實(shí)LMP1在鼻咽上皮與鼻咽癌組織中對(duì)上述蛋白表達(dá)的影響，我們選取其中2個(gè)腫瘤相關(guān)且表達(dá)差異最大的蛋白p27和RPLP0，檢測(cè)了它們分別在鼻咽上皮和鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，并分析與LMP1表達(dá)的相關(guān)性，為闡明LMP1在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

p27蛋白是一種廣譜細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶(cyclin－dependent kinase，CDK)抑制劑，屬于細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子CDKI家族成員之一，通過(guò)抑制cyclin/CDK復(fù)合物的活性，阻止Rb磷酸化，使細(xì)胞周期停滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖，在真核細(xì)胞周期調(diào)控中起到重要作用[6－7]。至今，已經(jīng)在多種腫瘤中檢測(cè)到p27表達(dá)下降或者缺失，如口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]、淋巴瘤[9]、前列腺癌[10]和乳腺癌[11]等，提示p27表達(dá)的降低可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。我們?cè)诒茄噬掀そM織與鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LMP1表達(dá)后細(xì)胞中p27蛋白表達(dá)降低，結(jié)果提示LMP1可能參與抑制p27蛋白的表達(dá)。LMP1作為EB病毒編碼的重要致瘤蛋白，通過(guò)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與促細(xì)胞的增殖，及誘導(dǎo)細(xì)胞惡變[12－13]。因此，我們推測(cè)LMP1抑制p27蛋白的表達(dá)可能在發(fā)揮其致瘤過(guò)程中起一定的作用。另外，我們分析了解到患者年齡小、LMP1(－)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM I期和II期時(shí)，p27蛋白表達(dá)陽(yáng)性率相對(duì)較高，結(jié)果說(shuō)明p27蛋白的表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系，我們推測(cè)LMP1可能通過(guò)抑制該蛋白的表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移，但具體分子機(jī)制有待后續(xù)繼續(xù)深入。

RPLP0作為核糖體大亞基上的一個(gè)重要組成部分，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成過(guò)程，是維持核糖體穩(wěn)定性和活性必不可少的[14]。完整的RPLP0蛋白是保持細(xì)胞活性所必需的，其參與蛋白合成延伸階段的調(diào)節(jié)作用，在蛋白翻譯的延伸階段有利于mRNA的移動(dòng)和脫酰tRNA的移開(kāi)。當(dāng)其缺失后可導(dǎo)致60S rRNA 組裝嚴(yán)重不足，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15－16]。我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LMP1在鼻咽上皮細(xì)胞和鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)，RPLP0蛋白表達(dá)增加，推測(cè)LMP1促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)RPLP0蛋白的表達(dá)，穩(wěn)定并增強(qiáng)核糖體蛋白的功能，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，為細(xì)胞的分裂與增殖提供必需的物質(zhì)基礎(chǔ)，但其中可能的調(diào)節(jié)機(jī)制需我們進(jìn)一步深入研究。另外，我們觀察到鼻咽癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期患者中RPLP0蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高，提示該蛋白有望成為評(píng)估患者分期與預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)之一，由于樣本量有限，臨床應(yīng)用前仍有待大樣本的進(jìn)一步分析證實(shí)。

[1]Cao JY，Mansouri S，F(xiàn)rappier L.Changes in the nasopharyngeal carcinoma nuclear proteome induced by the EBNA1 protein of Epstein－Barr virus reveal potential roles for EBNA1 in metastasis and oxidative stress responses[J].J Virol，2012，86(1):382 －394.

[2]Zhao Y，Wang Y，Zeng S，et al.LMP1 expression is positively associated with metastasis of nasopharyngeal carcinoma:evidence from a meta － analysis[J].J Clin Pathol，2012，65(1):41－45.

[3]Zhang Q，Zhang ZW，Wang CK，et al.Proteome analysis of the transformation potential of the Epstein－Barr virusencoded latent membrane protein 1 in nasopharyngeal epithelial cells NP69[J].Mol Cell Biochem，2008，314(1－2):73－83.

[4]張志偉，張 瓊，余艷輝，等.Epstein－Barr病毒潛伏性膜蛋白1 CTAR3缺失突變體的構(gòu)建與功能分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2008，48(10):1308－1313.

[5]張志偉，張 瓊，余艷輝，等.EB病毒 LMP1－CTAR3對(duì)NP69細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)進(jìn)展，2009，36(5):580－586.

[6]Wander SA，Zhao D，Slingerland JM.p27:a barometer of signaling deregulation and potential predictor of response to targeted therapies[J].Clin Cancer Res，2011，17(1):12－18.

[7]Liu J，Zhang D，Mi X，et al.p27 suppresses arsenite －induced Hsp27/Hsp70 expression through inhibiting JNK2/c－Jun－ and HSF－1－dependent pathways[J].JBiol Chem，2010，285(34):26058 －26065.

[8]Queiroz AB，F(xiàn)occhi G，Dobo C，et al.Expression of p27，p21WAF/Cip1，and p16INK4ain normal oral epithelium，oral squamous papilloma，and oral squamous cell carcinoma[J].Anticancer Res，2010，30(7):2799 －2803.

[9]Gazzola A，Sista MT，Agostinelli C，et al.CDKN1B/p27 expression in peripheral T cell lymphoma not otherwise specified[J].J Clin Pathol，2011，64(1):83 －87.

[10]Morishita D，Takami M，Yoshikawa S，et al.Cell－permeable carboxyl－ terminal p27Kip1peptide exhibits antitumor activity by inhibiting Pim － 1 kinase[J].J Biol Chem，2011，286(4):2681－2688.

[11]Guan X，Wang Y，Xie R，et al.p27Kip1as a prognostic factor in breast cancer:a systematic review and meta－analysis[J].J Cell Mol Med，2010，14(4):944－953.

[12]張志偉，劉潔瓊，余艷輝，等.EB病毒LMP1促鼻咽上皮細(xì)胞增殖的蛋白分子鑒定[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26(2):287－292.

[13]張志偉，賀智敏，周 敏，等.NF－κB介導(dǎo)的 EBVLMP1在Rat－1細(xì)胞轉(zhuǎn)化和成瘤中的作用[J].癌癥，2007，26(2):118－122.

[14]Artero － Castro A，Castellvi J，García A，et al.Expression of the ribosomal proteins Rplp0，Rplp1，and Rplp2 in gynecologic tumors[J].Hum Pathol，2011，42(2):194－203.

[15]Rodríguez － Mateos M，García － Gómez JJ，F(xiàn)rancisco －Velilla R，et al.Role and dynamics of the ribosomal protein P0 and its related trans－acting factor Mrt4 during ribosome assembly in Saccharomyces cerevisiae[J].Nucleic Acids Res，2009，37(22):7519 －7532.

[16]Sehgal A，Kumar N，Carruthers VB，et al.Translocation of ribosomal protein P0 onto the Toxoplasma gondii tachyzoite surface[J].Int J Parasitol，2003，33(14):1589－1594.