章杰兵，于 雷，劉 梅，馬 靜，魯 毅，邱 彥（.南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，江蘇 南京 000；.解放軍454醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 000）

創(chuàng)傷出血是誘發(fā)死亡的常見因素之一，及時有效地止血是挽救傷員生命的關(guān)鍵[1]。在傷口止血后，傷口的愈合是一個較復(fù)雜的過程，傷口細菌感染直接阻礙傷口的愈合速度，并且還有可能產(chǎn)生對生命有威脅的并發(fā)癥。目前傷口感染的主要致病菌多以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等為主，由此造成的死亡率居高不下[2]。因此，對于高效止血、抗感染、加速愈合等功能多樣化的新型止血材料的研究，已成為當前醫(yī)藥領(lǐng)域研究熱點。

隨著近幾年靜電紡絲技術(shù)的不斷發(fā)展，靜電紡納米纖維在創(chuàng)傷敷料方面的應(yīng)用也越來越多。納米纖維材料可用于人體皮膚創(chuàng)傷和燒傷處理，而且經(jīng)載藥處理可具有抗菌消炎的作用[3]。血余炭是人發(fā)制成的炭化物，烏黑光亮，有多數(shù)細孔，體輕，質(zhì)脆；具有止血消瘀、補陰利尿之功效。本實驗中，我們將血余炭作為添加藥物，以生物相容性較好的聚乳酸作為納米纖維膜基體，制備出一種新型的創(chuàng)傷止血材料，并對其體內(nèi)、外抗菌活性進行了實驗研究。

1 材料

1.1 儀器

FA2004電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；0300MM電子數(shù)顯游標卡尺（上海量具刃具廠）；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）；BGG6-358高壓靜電發(fā)生器（北京機電院高等技術(shù)股份有限公司）；98-1型磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；JSM-5600LV掃描電子顯微鏡（JEOL）；D/max-2550PC型X射線衍射儀（日本理學(xué)公司）。

1.2 藥物與試劑

醫(yī)用脫脂紗布（上海宏隆醫(yī)療用品設(shè)備有限公司，批號100507）；抗菌醫(yī)用敷料（愈邦，南京金地普慧醫(yī)藥科技有限公司，批號12C06021）；未載血余炭納米纖維膜及載血余炭納米纖維膜（本實驗室制備）。聚乳酸（PLLA，濟南岱罡生物科技有限公司）；氯仿（分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；丙酮（分析純，中國上海試劑總廠）；戊巴比妥鈉（德國分裝 RT，批號WS20080810）。

1.3 動物與菌株

新西蘭大白兔，雄性，體重2～2.5 kg，普通級，由上海市奉賢區(qū)泰日鎮(zhèn)銀根養(yǎng)兔室提供，實驗動物許可證號碼：SCXK（滬）2005-0003。金黃色葡萄球菌（ATCC25923），大腸桿菌（ATCC25922），銅綠假單胞菌（ATCC27853）由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院臨床檢驗科鑒定并提供。

2 方法

2.1 血余炭納米纖維膜的制備

實驗制備的納米纖維膜中血余炭的含量為0.5 wt%。將血余炭預(yù)先經(jīng)過研磨，過篩（篩孔5.5 μm），保證其顆粒細小、均勻。在配制PLLA溶液時，計算出所需PLLA的質(zhì)量，稱量好將其加入到封口瓶中，按照質(zhì)量比（10∶1）稱一定量的血余炭，再向瓶中加入一定量體積的氯仿，密封瓶口，放在磁力攪拌器上攪拌3 h。將瓶口打開加入適量丙酮（加入丙酮與氯仿的體積比為1∶2），密封，在磁力攪拌器上攪拌1 h即可。

工藝參數(shù)：溶液濃度5%，電壓20 kv，紡絲距離15 cm，溶液擠出速度1.0 mL·h-1。用掃描電子顯微鏡和X射線衍射儀分別對其形貌結(jié)構(gòu)和成分進行分析。

2.2 體外抗菌實驗（瓊脂擴散法）

2.2.1 實驗分組及樣本片制備 分為空白對照組（醫(yī)用脫脂紗布）、陽性對照組（納米銀抗菌醫(yī)用敷料）、未載血余炭納米纖維膜組、載血余炭納米纖維膜組。實驗所用受試材料均為無菌材料，分別將其剪成直徑為5 mm的圓片，備用。每組共15個樣本，每菌種5個樣本。

2.2.2 菌液、含菌平板制備 參照文獻[4-5]方法制備三種細菌菌液，調(diào)整濃度至1.5×108個·mL-1；然后分別制成含菌平板。

2.2.3 抑菌效果測定[6]用無菌鑷子將四種樣本片分別貼放在1個含菌平板上。放入37 ℃孵箱中培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果，用游標卡尺精確測量抑菌環(huán)直徑的大?。╩m），測3次取平均值。以抑菌環(huán)直徑＞ 7.0 mm為有抑菌作用，實驗方法及測定主要參照中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布的《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002版）中抗（抑）菌試驗評價規(guī)定，抑菌作用的判斷：抑菌環(huán)直徑大于7 mm者，判為有抑菌作用；抑菌環(huán)直徑小于或等于7 mm者，判為無抑菌作用。每菌種實驗重復(fù)5次。

2.3 體內(nèi)抗菌活性實驗

2.3.1 創(chuàng)傷細菌感染模型制備[7-9]新西蘭大白兔10只（每只兔子背部做4個創(chuàng)面，共形成40個感染創(chuàng)面，然后將40個創(chuàng)面平均分為4組），耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，背部脫毛消毒，于背部脊柱兩側(cè)各形成2個直徑2 cm的圓形創(chuàng)面，深達肌層，致傷后每個創(chuàng)面滴加金黃色葡萄球菌0.1 mL（濃度為1.0×108個·mL-1）造成創(chuàng)面感染。

2.3.2 分組及給藥 隨機將創(chuàng)面分為4組，分組同“2.2.1”。每個創(chuàng)面按分組給予相應(yīng)的材料（3.5 cm×3.5 cm）治療，空白對照組的創(chuàng)面使用相同面積大小的醫(yī)用紗布包扎；每天換藥1次。分別在給藥后24，48，72 h進行細菌學(xué)定量檢測，觀察創(chuàng)面情況。

2.3.3 組織勻漿細菌定量檢測 參照文獻[10]檢測方法，無菌操作取下創(chuàng)面中心組織，加入無菌氯化鈉注射液制成10%組織勻漿；然后依次稀釋10，102，103，104倍后，取每個稀釋濃度液0.1 mL分別涂布瓊脂培養(yǎng)皿，置于37 ℃培養(yǎng)箱24 h，常溫下再放置24 h后細菌計數(shù)。

2.3.4 組織病理學(xué)檢查 于術(shù)后72 h剖取整塊創(chuàng)面組織，用10%甲醛固定后，經(jīng)創(chuàng)面中心取材作石臘包埋切片，HE染色后鏡下觀察組織學(xué)變化。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用（±s）表示，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組間差異顯著性采用多因素方差分析進行檢驗，顯著性水平α = 0.05。

3 結(jié)果

3.1 納米纖維膜的形貌結(jié)構(gòu)與成分分析

掃描電鏡觀察到納米纖維膜的形貌及結(jié)構(gòu)，如圖1。實驗制備得到了直徑相對較小且均勻，無串珠的纖維氈，纖維平均直徑為400 nm。從圖中納米纖維膜結(jié)構(gòu)可以看出，除纖維之外，沒有多余的顆粒結(jié)構(gòu)存在，反映血余炭與成纖維聚合物之間良好的相容性，并且其加入對纖維的形貌幾乎沒有影響。為了進一步驗證血余炭成分是否在納米纖維膜中，對其進行了XRD分析，結(jié)果見圖2，可以看出，在載血余炭納米纖維膜的XRD圖譜中，出現(xiàn)了幾個比較尖銳的結(jié)晶峰，經(jīng)分析得出，主要是血余炭的峰，進一步說明血余炭成分已經(jīng)分散載入到納米纖維膜中。

圖1 納米纖維膜掃描電鏡圖片注：a-不載血余炭；b-載血余炭Fig 1 SEM photographs of nano-fibers tunicNote：a-nano-fibers tunic without carbonized hair; b-nano-fibers tunic with carbonized hair

3.2 對不同細菌體外抑菌作用的影響

實驗結(jié)果顯示，醫(yī)用脫脂紗布和不載血余炭納米纖維膜對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌均未表現(xiàn)出抗菌活性，未見抑菌環(huán)，無抗菌作用；載血余炭納米纖維膜和抗菌醫(yī)用敷料抑菌環(huán)都在7 mm以上，與抗菌醫(yī)用敷料比，載血余炭納米纖維膜對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抑菌環(huán)有差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，P＜ 0.01），對大腸桿菌的抑菌環(huán)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明載血余炭納米纖維膜具有較強的抗菌活性。結(jié)果見表1。

圖2 納米纖維膜的XRD圖譜注：c-不載血余炭；d-載血余炭Fig 2 The XRD of nano-fibers tunicNote：c-nano-fibers tunic without carbonized hair; d-nano-fibers tunic with carbonized hair

表1 血余炭納米纖維膜體外抑菌環(huán)直徑測定結(jié)果.n = 5, ±sTab 1 Diameter of bacterial inhibitory zone in vitro of the NTCH.n = 5, ±s

表1 血余炭納米纖維膜體外抑菌環(huán)直徑測定結(jié)果.n = 5, ±sTab 1 Diameter of bacterial inhibitory zone in vitro of the NTCH.n = 5, ±s

注：與抗菌醫(yī)用敷料組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with antiseptic medical dressing group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

組別 對不同細菌的抑菌環(huán)直徑/mm金黃色葡萄球菌 大腸桿菌 銅綠假單胞菌空白對照組 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00不載血余炭納米纖維膜組0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00抗菌醫(yī)用敷料組 12.42±1.87 8.58±1.08 11.13±1.48載血余炭納米纖維膜組17.96±2.09** 10.57±1.86 14.25±1.95*

3.3 對創(chuàng)傷細菌感染動物模型的影響

3.3.1 肉眼觀察創(chuàng)面情況 創(chuàng)面形成24 h后有少量淡黃色分泌物滲出，傷口周圍輕度腫脹。給藥72 h后，醫(yī)用脫脂紗布組及不載血余炭納米纖維膜組創(chuàng)面均有大量的黃白色黏稠分泌物滲出，創(chuàng)口周圍紅腫較明顯；而抗菌醫(yī)用敷料組及載血余炭納米纖維膜組創(chuàng)面僅有少量淡黃色稀薄分泌物，創(chuàng)口紅潤，腫脹明顯減輕。

3.3.2 組織內(nèi)細菌含量變化 術(shù)后空白對照組創(chuàng)面組織內(nèi)細菌含量明顯增多，72 h細菌含量已達到109水平；不載血余炭納米纖維膜組在不同時間點與空白對照組比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。與空白對照組比，同時間點抗菌醫(yī)用敷料組及載血余炭納米纖維膜組創(chuàng)面組織內(nèi)細菌含量均顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。其中，實驗觀察期間內(nèi)，在給予血余炭納米纖維膜治療72 h后創(chuàng)面組織內(nèi)細菌含量低于105個·g-1組織，符合臨床無感染的標準，促進傷口愈合，抗菌效果相對較好。結(jié)果見表2。

表2 不同組別術(shù)后感染傷口細菌數(shù)量.個·g-1組織， n = 10，±sTab 2 The number of bacteria of infected wounds in different groups.g-1 tissue, n = 10, ±s

表2 不同組別術(shù)后感染傷口細菌數(shù)量.個·g-1組織， n = 10，±sTab 2 The number of bacteria of infected wounds in different groups.g-1 tissue, n = 10, ±s

注：與空白對照組比，**P ＜ 0.01Note: compared with the blank control group, **P ＜ 0.01

術(shù)后不同時間點24 h 48 h 72 h空白對照組 （7.13±2.07）×106 （1.47±0.79）×108 （2.90±1.17）×109不載血余炭納米纖維膜組 （6.43±2.22）×106 （1.02±0.47）×108 （2.69±1.22）×109抗菌醫(yī)用敷料組 （3.76±1.15）×105** （7.92±1.73）×105** （1.33±0.73）×105**載血余炭納米纖維膜組 （2.96±1.12）×105** （3.52±1.42）×105** （7.62±1.87）×104**組別

3.3.3 組織病理學(xué)觀察

空白對照組創(chuàng)面有大量炎癥細胞的壞死組織，其下組織有明顯的細胞腫脹，有大量炎癥細胞浸潤；不載血余炭納米纖維膜組與空白對照組比沒有明顯區(qū)別；抗菌醫(yī)用敷料組可見壞死組織的痂皮脫落，其下組織有少量的炎癥細胞；載血余炭納米纖維膜組痂皮脫落，創(chuàng)面已被表皮覆蓋，其下組織中有一些新生血管，尚有較少的炎癥細胞。

4 討論

感染是影響創(chuàng)面愈合的主要因素，雖然一些外用抗感染藥物如磺胺嘧啶、硝酸鈰等，對抑制創(chuàng)面感染有一定的功效，但多種抗生素的使用會造成耐藥性菌株的產(chǎn)生或發(fā)生各種藥物副作用。在創(chuàng)面感染形成過程中，創(chuàng)面組織中細菌含量是感染發(fā)生的一個重要因素。當細菌含量超過105個·g-1組織，傷口將不愈合[11]。

從本實驗結(jié)果看，血余炭納米纖維膜治療后，創(chuàng)面組織內(nèi)細菌[（7.62±1.87）×104個·g-1組織]含量低于105個·g-1組織，提示血余炭納米纖維膜可以使創(chuàng)面達到臨床無感染的標準，加速傷口的愈合。體外抑菌實驗中，血余炭納米纖維膜對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌均有一定的抑制作用。血余炭納米纖維膜不僅具有止血作用，而且有抗菌、消炎的功效，能快速有效地控制創(chuàng)面感染，從而使其作用發(fā)揮最大功能化。

血余炭主要化學(xué)成分為鈣、銅等金屬的氧化物或鹽類。經(jīng)藥理研究表明血余炭具有明顯的凝血、血管栓塞、止血作用[12]；血余炭煎劑對金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌及福氏痢疾桿菌有較強的抑制作用[13]，其抗菌作用機制可能是影響細菌對糖和蛋白質(zhì)代謝的結(jié)果；抑制金黃色葡萄球菌等對葡萄糖和蛋白質(zhì)的代謝，改變細菌的代謝機制，破壞或抑制了其對周圍物質(zhì)選擇性通透性，干擾或破壞菌內(nèi)氧化還原狀態(tài)，從而影響了細菌新陳代謝。中藥炒炭后所含大量炭素、鞣質(zhì)、鈣及微量元素，可供傷口愈合營養(yǎng)素代謝之所需；納米纖維膜的多孔性結(jié)構(gòu)有利于組織內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)和氧的交換，促進創(chuàng)傷部位組織細胞的修復(fù)，恢復(fù)正常功能；以上諸多因素促使其發(fā)揮抗菌作用，促進傷口愈合。血余炭抗菌作用較為復(fù)雜，并非單一成分發(fā)揮作用，它是一個多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點的綜合作用，對其抗菌作用詳細機理，還有待深入論證。

靜電紡絲纖維具有獨特的性能：比表面積高、力學(xué)性能優(yōu)異、多孔性、質(zhì)量輕、載藥量高、藥物釋放可控、成本低等[14]。利用新型靜電紡絲技術(shù)，將血余炭載入納米纖維內(nèi)，形成一種具有一定柔韌性和強度，透氣、生物相容性較好的血余炭納米纖維膜，使其充分發(fā)揮止血、消炎、抗菌、加速傷口愈合等作用。血余炭納米纖維膜作為一種作用廣泛、使用方便、易攜帶、安全耐用且成本低廉的新型止血材料，在臨床急救止血領(lǐng)域中將有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

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