(邯鄲市第一醫(yī)院，河北邯鄲 056002)

卵巢癌尤其是上皮性卵巢癌(EOC)早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，至今其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種類型的腫瘤包括卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展與信號(hào)傳導(dǎo)通路異常有關(guān)。蛋白激酶B(PKB/AKT)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。一旦AKT被激活，它可以磷酸化與細(xì)胞凋亡相關(guān)的底物蛋白，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和化療耐藥。AKT是3-羧基磷脂酰肌醇激酶(PI3K)的一個(gè)重要靶基因，二者構(gòu)成細(xì)胞對(duì)外應(yīng)激反應(yīng)過程中促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡和維持細(xì)胞重要功能的信號(hào)傳遞鏈。與張力蛋白同源的第10染色體丟失的磷酸酶基因(PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重磷酸酶活性的抑癌基因，其表達(dá)缺失可使PI3K/AKT信號(hào)途徑異?；罨瑥亩龠M(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生［1］。近期我們采用免疫組化方法觀察了卵巢上皮性癌組織中p-AKT和PTEN蛋白的表達(dá)情況并分析其與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，旨在為卵巢癌尋找新的基因治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)本:選自邯鄲市第一醫(yī)院2008年10月～2010年12月住院患者存檔的手術(shù)石蠟標(biāo)本，其中正常卵巢組織10份(正常組，受檢者年齡22～58歲，中位年齡40歲);卵巢良性上皮腫瘤組織20份(良性組，患者年齡20～50歲，中位年齡35歲);卵巢上皮癌組織60份(卵巢癌組，患者年齡35～75歲，中位年齡55歲，腫瘤均為初發(fā)，術(shù)前均未接受過放、化療)，病理分級(jí):G1 18例，G2 15例，G3 27例;病理分期(國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟1988年標(biāo)準(zhǔn)):Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ 、Ⅳ期38例。試劑:兔抗人 p-AKT(ser 473)多克隆抗體(工作濃度1∶50)購(gòu)自 Cell SignalingTechnology公司;兔抗人 PTEN(工作濃度1∶100)多克隆抗體、DAB顯色劑、過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素標(biāo)記盒、試劑盒均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 p-AKT及PTEN蛋白表達(dá)測(cè)定 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶連接(SP)法，每批染色均設(shè)陰性和陽性對(duì)照。陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，陽性對(duì)照分別取已知p-AKT及PTEN蛋白表達(dá)陽性的乳腺癌組織的石蠟切片。結(jié)果判斷:①陽性細(xì)胞比例計(jì)分:光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取其平均值，陽性細(xì)胞比例≤10%為1分，10% ～50%為2分，50% ～75%為3分;≥75%為4分。②陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分:細(xì)胞無顯色為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;黃褐色為3分。陽性細(xì)胞比例與細(xì)胞染色強(qiáng)度積分乘積0分為(－)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++);積分范圍0～12分，≥4分為陽性表達(dá)。

1.2.3 相關(guān)性分析 分析p-AKT及PTEN蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系及卵巢癌組織p-AKT與PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。p-AKT和PTEN表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，Spearman等級(jí)相關(guān)法分析二者的相關(guān)性。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-AKT及PTEN表達(dá) 各組p-AKT及PTEN陽性表達(dá)率比較見表1。

表1 各組p-AKT和PTEN表達(dá)陽性率比較(%)

2.2 p-AKT、PTEN蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表2。

2.3 卵巢癌組織中p-AKT和PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性 p-AKT和PTEN均為陽性表達(dá)的標(biāo)本為7例，在27例PTEN蛋白陽性表達(dá)者中7例伴有p-AKT蛋白過度表達(dá)，32例p-AKT陽性表達(dá)者中7例伴有PTEN過度表達(dá)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，p-AKT和PTEN在卵巢癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.497，P ＜0.001)。

3 討論

表2 P-AKT和PTEN蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

研究顯示，許多信號(hào)傳導(dǎo)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，信號(hào)傳導(dǎo)通路中癌基因異?；罨鸵职┗蚴Щ钍怯绊懩[瘤惡性生物學(xué)行為及預(yù)后的重要因素。近年來臨床致力于信號(hào)傳導(dǎo)通路與惡性腫瘤關(guān)系的研究，旨在通過對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制的研究尋找新的治療靶基因。

PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路中某些成分突變所導(dǎo)致的功能獲得或缺失能夠引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)。AKT由氨基端的PH結(jié)構(gòu)域、中間的激酶活性區(qū)及羧基端的尾部三部分構(gòu)成。AKT一旦被激活，即可磷酸化部分與細(xì)胞凋亡相關(guān)的底物蛋白，如 Bcl-2 相關(guān)促死蛋白(Bad)、Caspase 9［2］等，在腫瘤發(fā)生和化療耐藥等方面扮演重要角色［3］;目前有許多關(guān)于AKT可保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)入編程性死亡的報(bào)道［4］。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN功能缺失可導(dǎo)致PI3K途徑的成分如AKT活性增加，而PTEN高表達(dá)可通過抑制AKT活性使細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)亡［5］;有報(bào)道在卵巢癌細(xì)胞中PI3K催化亞單位(P110)擴(kuò)增可導(dǎo)致AKT變異和PTEN功能缺失［6］，引起細(xì)胞抵抗死亡或死亡延遲［7］，從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生。

本研究卵巢癌組PTEN陽性表達(dá)率明顯低于正常組;卵巢癌組織中PTEN表達(dá)缺失與其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制減弱有關(guān)，可促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌臨床期別越晚、分化程度越低，PTEN陽性表達(dá)率越低，即晚期和分化差的卵巢癌中出現(xiàn)PTEN蛋白丟失現(xiàn)象普遍存在;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者PTEN陽性率顯著降低，提示PTEN表達(dá)水平下降可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN除可抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)外，還可提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)抗癌基因的敏感性，因此改變PTEN的轉(zhuǎn)錄水平可影響PI3K/AKT途徑進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)p-AKT在正常組及良性組不表達(dá)或呈弱表達(dá)，而在卵巢癌組織中呈高表達(dá) ，提示p-AKT在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。臨床期別越晚，p-AKT陽性表達(dá)率越高，提示p-AKT參與了卵巢癌的發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移;腫瘤分化程度越差，p-AKT的陽性表達(dá)率越低，表明AKT活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的的惡性增生、轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步說明p-AKT參與了卵巢癌的發(fā)展。本研究有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者p-AKT蛋白陽性表達(dá)率顯著升高，其機(jī)制可能為AKT通過激活其底物如增加細(xì)胞周期素D轉(zhuǎn)錄、磷酸化P21使細(xì)胞周期加速，促進(jìn)腫瘤發(fā)展，提示AKT活化與卵巢癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。p-AKT的表達(dá)與年齡、病理類型及有無腹水無關(guān)，表明AKT作為細(xì)胞生存的一個(gè)關(guān)鍵因子，對(duì)于腫瘤的形成模式及其診斷、治療可能具有十分重要的意義。有研究發(fā)現(xiàn)從正常到不典型再到惡性轉(zhuǎn)化過程中，p-AKT表達(dá)水平逐漸增高，且伴隨凋亡相關(guān)分子標(biāo)志物丟失［8］，支持AKT在腫瘤發(fā)展中可提高腫瘤生存能力的理論。

本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中P-AKT的過表達(dá)伴隨PTEN的丟失，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。PTEN蛋白表達(dá)缺失失去了對(duì)AKT的抑制作用，使AKT活化，p-AKT過表達(dá)，兩者共同促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展。PTEN使磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)的3’脫磷酸形成PIP2，PTEN表達(dá)缺失伴隨PIP3水平增高使AKT過度表達(dá)，增加了細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性［9］。Kurose等［10］采用免疫組化和RT-PCR法觀察了兩者在卵巢癌組織中的關(guān)系得出類似結(jié)論，與Kanamori在子宮內(nèi)膜癌中的研究結(jié)論一致，本研究結(jié)果與此結(jié)論亦一致。

分析本研究結(jié)果，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可能對(duì)卵巢癌的治療具有重要作用。PI3K抑制劑可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的程序性死亡，提示阻斷PI3K/AKT通路異常激活或恢復(fù)PTEN的功能是治療卵巢癌的有效方法。

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