劉家秀，許國(guó)瑩，徐 彬，王莉娟，潘繼承

(1淮陰衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇淮安 223300;2淮安市傳染病醫(yī)院;3江蘇省省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院)

長(zhǎng)期以來(lái)，在乙型病毒性肝病(HB)的發(fā)病機(jī)制中，免疫應(yīng)答及細(xì)胞因子的作用一直受到國(guó)內(nèi)、外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Th17細(xì)胞(Thelp cell 17)是一類新發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)性CD+4Th細(xì)胞亞群，獨(dú)立于Th1和Th2［1］。其發(fā)現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的Th1/Th2模式在解釋疾病免疫病理機(jī)制中的局限性，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞分泌的 IL-17、IL-17F、IL-21、IL-6、IL-22 和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子參與了肝臟損傷及再生過(guò)程，在脂肪肝、自身免疫性肝病及肝臟腫瘤中發(fā)揮重要作用［2］。2010年1月～2011年6月，我們檢測(cè)了HB患者外周血IL-17、IL-22變化，并分析其與肝纖維化指標(biāo)的關(guān)系，旨在為HB的診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 84例HB患者為2010年1月～2011年6月淮安市傳染病防治院門診和住院患者，男52例，女32例;年齡26～78歲，平均42.5歲。急性肝炎18例(急性肝炎組)，慢性肝炎26例(慢性肝炎組)，肝硬化24例(肝硬化組)，肝癌16例(肝癌組)。所有病例均符合2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)制定的《病毒性肝炎防治方案》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，并排除合并感染其他病毒性肝炎，排除心、腦、腎、肺等器官疾病及高血壓、糖尿病等。健康組為40例健康體檢者，其中男28例，女12例，年齡26～67，平均39.3歲。各組性別及年齡有可比性。

1.2 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 各組均取空腹靜脈分離血清，于－80℃保存，行以下指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.1 IL-17及 IL-22水平 IL-17檢測(cè)采用單克隆抗體夾心ELISA法，由全自動(dòng)酶免分析儀測(cè)定結(jié)果，試劑盒由Sigma公司提供，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)操作。血清IL-22檢測(cè)采用IL-22抗體(Santa Cruz，美國(guó))包被于反應(yīng)板微孔，于4℃過(guò)夜;用含10 g/dL BSA的封閉液37℃封閉2 h，于每孔中加入待檢樣本并于37℃孵育2 h，洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG(Zymed Laboratories，美國(guó))于37℃孵育1 h，加人TMB顯色液，采用酶聯(lián)儀450 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色分析，讀取A值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較進(jìn)而獲取IL-22血清表達(dá)水平。

1.2.2 透明質(zhì)酸(HA)、層黏蛋白(LN)和Ⅳ型膠原蛋白(ⅣC)水平采用ELISA法測(cè)定，試劑盒由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供。

1.2.3 總膽紅素(TBIL)和 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶((γ-GT)水平 采用常規(guī)自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.2.4 相關(guān)性分析 對(duì)IL-17及IL-22水平與ⅣC、LN和HA及肝癌組IL-22水平與TBIL、γ-GT水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用±s表示，均數(shù)間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spear-man線性相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17及IL-22水平 見(jiàn)表1。

表1 各組IL-17、IL-22水平比較(±s)

表1 各組IL-17、IL-22水平比較(±s)

注:與健康組比較，▲P ＜0.01;與急性肝炎組比較，#P ＜0.05;與慢性肝炎組比較，*P ＜0.05;與肝硬化組比較，△P ＜0.05

組別 n IL-17(ng/mL) IL-22(pg/mL)急性肝炎組 18 123.32±32.62▲△ 450.68±43.26▲△慢性肝炎組 26 106.63±35.21▲△ 530.14±24.23▲△肝硬化組 24 401.41 ±25.27▲#* 683.42 ±76.28▲#*肝癌組 16 1462.58 ±10.02▲#＊△ 824.53 ±64.20▲#＊△健康組 40 35.24±11.25#＊△ 384.32±86.83#＊△

2.2 ⅣC、LN、HA及TBIL、γ-GT水平 見(jiàn)表2。

2.3 相關(guān)性分析 IL-17、IL-22分別與HA、LN和ⅣC水平呈正相關(guān)，見(jiàn)表3;肝癌組 IL-22水平與TBIL、γ-GT 水平均呈正相關(guān)，r分別 =0.384、0.358，P 均 ＜0.05。

表2 各組ⅣC、LN、HA及TBIL、γ-GT水平比較(±s)

表2 各組ⅣC、LN、HA及TBIL、γ-GT水平比較(±s)

注:與健康組比較，▲P ＜0.05，與急性肝炎組比較，#P ＜0.05，與慢性肝炎組比較，*P ＜0.05，與肝硬化組比較，△P ＜0.05

組別 n ⅣC(ng/mL) LN(ng/mL) HA(ng/mL) TBIL(μmol/L) γ-GT(IU/L)急性肝炎組 18 106.21±21.70＊△ 98.46±10.12＊△ 98.54±31.25＊△ 112.31±15.34＊△ 76.14±21.02＊△慢性肝炎組 26 265.56 ±32.21▲#△ 122.24 ±12.10#△ 148.42 ±22.10▲#△ 68.64 ±22.13# 246.54 ±20.32#肝硬化組 24 450.68 ±52.27▲#* 348.20 ±76.28▲#* 368.39 ±13.27▲#* 70.28 ±31.22# 269.36 ±41.16#肝癌組 16 786.91 ±16.28▲#＊△ 753.45 ±20.15▲#＊△ 743.19 ±58.03▲#＊△ 116.46 ±32.24▲＊△ 501.26 ±42.38▲#＊△健康組 40 94.42 ±56.21 92.43 ±13.22 85.12 ±12.24 14.26 ±6.31 34.26 ±12.23

表3 IL-17、IL-22與ⅣC、LN和HA的相關(guān)性

3 討論

Th17細(xì)胞是2005年新發(fā)現(xiàn)的第三種效應(yīng)性Th細(xì)胞亞群［4］。Thl7細(xì)胞的提出是對(duì)Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷假說(shuō)的第一次修訂，具有里程碑意義［5］。在肝臟相關(guān)疾病中，Th17細(xì)胞分泌的IL-17、IL-17F、IL-21、IL-6、IL-22 等細(xì)胞因子通路與肝臟損傷的密切關(guān)系得到越來(lái)越多的證據(jù)支持。

IL-17是Th17細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子之一。具有促炎癥作用，可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子(如IL-6、TNF)、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，引起組織細(xì)胞浸潤(rùn)和破壞;亦參與中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化，對(duì)T細(xì)胞的活化起協(xié)同刺激作用。IL-22是Th17細(xì)胞分泌的另一重要細(xì)胞因子，屬IL-10家族成員。在Th17細(xì)胞中，IL-22與IL-17一起分泌，有研究顯示，IL-22與IL-17共同表達(dá)可以認(rèn)為是自身攻擊性T細(xì)胞的標(biāo)志，兩者協(xié)同作用促進(jìn)炎性發(fā)生造成組織損傷［6］;但另有研究顯示，IL-22在急性肝損傷中起保護(hù)作用［7］。Th17細(xì)胞正是通過(guò)其分泌的多種細(xì)胞因子參與宿主防御、感染、腫瘤、自身免疫性疾病、移植排斥等病理過(guò)程。

本研究結(jié)果顯示，隨著肝病的進(jìn)展、肝損害嚴(yán)重程度加重，外周血IL-17及IL-22水平依次增高，以肝癌患者表達(dá)水平最高。肝纖維化或肝硬化是由于膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成與降解失衡、在肝內(nèi)過(guò)量沉積所致。近年來(lái)細(xì)胞外基質(zhì)HA、LN和ⅣC用于臨床纖維化的輔助診斷。有文獻(xiàn)報(bào)道，肝組織內(nèi)Thl7細(xì)胞主要集中于匯管區(qū)及纖維化區(qū)［8］，本研究結(jié)果顯示，隨肝病進(jìn)展，HA、LN 和ⅣC水平逐漸升高，且IL-17、IL-22分別與HA、LN和ⅣC水平呈正相關(guān);IL-22與TBIL、γ-GT均呈正相關(guān)。不僅提示Thl7細(xì)胞分泌的IL-17、IL-22在病毒感染后引起的免疫反應(yīng)與組織損傷有關(guān)，也進(jìn)一步提示IL-17、IL-22可能參與了肝纖維化的發(fā)生，尤其是IL-22在肝癌的形成中起重要作用。有報(bào)道，急性肝組織損傷時(shí)IL-22有限制肝細(xì)胞損傷的作用，此可能與IL-22可保護(hù)肝細(xì)胞免遭活化T細(xì)胞的破壞作用有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

目前，臨床上對(duì)各種肝病，尤其是肝纖維化、肝癌的診斷主要根據(jù)影像及肝組織活檢。雖然已開(kāi)展血清學(xué)相關(guān)免疫指標(biāo)及ECM檢查，但尚未能建立全面反映肝病全貌的血清學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果提示，檢測(cè)IL-17、IL-22結(jié)合相關(guān)指標(biāo)對(duì)慢性肝炎、肝纖維化和肝癌流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷、病情分析及預(yù)后判斷均具有重要價(jià)值;對(duì)IL-17、IL-22等細(xì)胞因子通路與肝臟損傷機(jī)理的深入研究，將為各類肝病的免疫干預(yù)治療提供新的靶點(diǎn)。

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