蔣 森，付海龍，徐廣峰，王秀芳，趙亞萍，杜云翔

(1蚌埠醫(yī)學院，安徽蚌埠 233000;2中國人民解放軍第82醫(yī)院)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA［1］，參與機體多種生理、病理機制。近年研究結(jié)果表明，人類Hsa-miR-1參與細胞生長、分化、凋亡及心臟、內(nèi)耳發(fā)育等生理過程，并與鼻咽癌、肺癌、胃癌等腫瘤發(fā)生有關［2～5］。食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國常見的消化道惡性腫瘤，HsamiR-1與ESCC發(fā)病關系的研究目前鮮見報道。2011年11月，我們觀察了Hsa-miR-1在ESCC細胞株中的表達情況，并通過多個在線數(shù)據(jù)庫、運用多個生物信息學軟件對Hsa-miR-1的生物學特征以及功能進行預測分析，旨在為后續(xù)的Hsa-miR-1功能研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細胞系ECA109、TE-1、KYSE-150和正常食管上皮細胞株Het-1A(均購自中科院上海細胞庫);胎牛血清(Gbico公司)，1640培養(yǎng)基(Gbico公司)，miRNeasy總RNA抽提試劑盒(德國QIAGEN公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國 ABI公司)，TaqMan MicroRNA Assay(美國 ABI公司)，ABI7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及Hsa-miR-1表達水平檢測 取上述KYSE-150及Het-1A細胞分別加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照試劑盒說明書步驟提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，使A260/A280值在1.8～2.0。根據(jù)試劑盒說明書操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄，采用實時熒光定量-PCR(RT-qPCR)檢測Hsa-miR-1水平，每組實驗至少重復3次。選擇miRNA-U6為內(nèi)參照，應用2-△CT方法計算目的基因相對表達水平。

1.3 數(shù)據(jù)來源 利用 miRBase(http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫查找Hsa-miR-1序列，選擇三種在線軟 件 TargetScan6.1［6］(http://www.targetscan.org/)、PicTar［7］(http://pictar.mdc-berlin.de/) 和miRanda［8］(http://www.microrna.org/) 預測 HsamiR-1的靶基因，取交集，結(jié)合 DIANA LAB-Tar-Base5.0(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/tarbase/)預測的Hsa-miR-1靶基因，進行后續(xù)生物信息學分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用GeneOntology對預測發(fā)現(xiàn)的Hsa-miR-1靶基因進行功能富集分類，利用Cytoscape中的插件BINGO［9］實現(xiàn)基因的GO富集分析。采用 DAVID 數(shù)據(jù)庫 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對Hsa-miR-1預測靶基因進行生物通路富集分析。使用超幾何分布計算P值，以P≤0.05為顯著性閾值，分別得到相對于背景具有統(tǒng)計意義的高頻率注釋。

2 結(jié)果

2.1 人食管癌細胞中Hsa-miR-1的表達 食管癌細胞株KYSE-150中Hsa-miR-1表達水平顯著低于正常食管上皮細胞株Het-1A細胞(P＜0.05)，見圖1。

圖1 KYSE-150及Het-1A中Hsa-miR-1表達

2.2 miR-1同源性 成熟體 miR-1的5'端種子序列(Seed sequence)在人(Hsa)、獼猴(mml)、家馬(eca)、文昌魚(bfl)、鴨嘴獸(oan)、安樂蜥(aca)、紅鰭東方鲀(fru)、斑胸草雀(tgu)等近100個物種上均顯示了很好的同源性(見表1)。

2.3 Hsa-miR-1所在基因組特征 Hsa-miR-1家族由2個miRNAs即Hsa-miR-1-1和Hsa-miR-1-2組成，有兩個Hsa-miR-1位點分別編碼Hsa-miR-1-1、Hsa-miR-1-2。Hsa-miR-1-1位于人的第20號染色體C20orf166基因初級轉(zhuǎn)錄本的第2個內(nèi)含子區(qū)。C20orf166基因包括4個外顯子、2個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，長度分別為1 220 bp和426 bp，C20orf166基因開放閱讀框(Openreading frame，ORF)大小為 354 bp。MiR-1-2位于人18號染色體上蛋白質(zhì)編碼基因MIB 1的第12個內(nèi)含子區(qū)，MIB1基因組全長為5 356 bp，屬于鋅指基因家族(Zinc fingers，ZZ-type［ZZZ］)，有21個外顯子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度為9 576 bp，開放閱讀框大小為3 021 bp。

表1 部分物種miR-1成熟序列

2.4 Hsa-miR-1 靶基因預測 DIANA LAB-Tar-Base5.0數(shù)據(jù)庫提供已經(jīng)有實驗數(shù)據(jù)支持microRNA的確切靶基因，通過檢索DIANA LAB-TarBase 5.0數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-1確認靶標有196個(表略)。應用 TargetScan、PicTar及 miRanda預測 Hsa-miR-1的靶基因，取三者預測結(jié)果的交集有106個基因，結(jié)合已證實的靶標基因，共267個。

2.5 Hsa-miR-1預測靶基因的GO分析及通路分析對所發(fā)現(xiàn)的267個Hsa-miR-1靶基因進行的GeneOntology注釋層次分類及富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-1靶基因在GO生物學過程注釋中，有5個基因個數(shù)超過預測靶基因數(shù)50%的富集群，這些富集群主要與生物代謝和調(diào)控等過程有關(表略);HsamiR-1靶基因在GO細胞組成分析注釋中，共有6個富集群基因個數(shù)超過預測靶基因數(shù)50%，主要參與細胞和細胞組分的形成(表略)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對267個靶基因進行的生物通路富集分析結(jié)果顯示，在經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫KEGG中，miR-1預測的靶基因富集于30個通路中，其中顯著的通路有癌癥通路(Pathways in cancer)、幽門螺旋桿菌感染的上皮細胞信號(Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection)、肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy)、擴張型心肌病(Dilated cardiomyopathy)、硫酸軟骨素的合成(Chondroitin sulfate biosynthesis)等7個通路(表略)。

3 討論

miRNA是近幾年分子醫(yī)學領域中最重要的發(fā)現(xiàn)之一，Calin等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA多定位于腫瘤相關的脆性位點，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，可能具有致癌基因或抑癌基因作用。最近一些研究證實，miR-1在多種腫瘤中表達異常，具有抑癌基因的作用，與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡密切相關，對于腫瘤的診斷、治療和預后具有重要意義［11～13］。本研究結(jié)果顯示，與正常食管上皮細胞相比，ESCC細胞中Hsa-miR-1表達明顯下調(diào)，提示Hsa-miR-1可能參與ESCC的發(fā)病機制，具有抑癌基因的作用。

miRBase上的數(shù)據(jù)顯示，至2012年6月，在植物、病毒、動物和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的miRNA已有18 000多種，其中人類miRNA有2 000多種。已有研究表明，一條miRNA通常具有調(diào)控多個基因的功能，而同一基因也可能同時受多個miRNA時空特異的精密調(diào)控，此種調(diào)控方式導致miRNA的功能研究頗具復雜性，僅依靠實驗手段研究miRNA已變得相當困難。生物信息學在miRNA研究中扮演著越來越重要的角色，其可通過對海量和復雜信息進行分析和處理而為下一步實驗提供指導，其在miRNA研究中的作用主要包括識別miRNA、對miRNA基因注釋、預測miRNA靶基因及分析miRNA芯片數(shù)據(jù)、miRNA功能、miRNA關聯(lián)疾病等。為更進一步了解Hsa-miR-1的生物學特征和功能，本研究分析了各物種miR-1的序列，發(fā)現(xiàn)成熟體 miR-1的5'端種子序列具有高度保守性。miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，其5'端2～8個核苷酸被稱為種子序列，對于其功能的正常發(fā)揮至關重要，種子序列主要通過與靶mRNA 3'端區(qū)域互補配對識別靶基因，負調(diào)控靶基因的表達［14］。在同源性miRNA中，這段序列通常是保守的，本研究中的序列比對分析也證實了此點。Hsa-miR-1在物種進化過程中的高度保守性，提示其在生命過程中可能發(fā)揮了重要功能。

已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA多位于腫瘤相關的染色體區(qū)域［15］，Hsa-miR-1 所處 染 色體也出 現(xiàn) 斷點［16～18］。本研究中靶基因預測出現(xiàn)與腫瘤相關的基因富集群，提示其可能參與了人類腫瘤的發(fā)生;ESCC細胞株Hsa-miR-1表達水平顯著下調(diào)的實驗結(jié)果亦進一步證實了生物信息學的推測。由于單個miRNA靶基因預測軟件具有一定局限性，且每個預測軟件的結(jié)果也不盡相同，本研究同時采用多個數(shù)據(jù)庫預測Hsa-miR-1靶基因結(jié)果、取交集，并結(jié)合實驗證實的靶基因進行分析，進一步提高了預測結(jié)果的準確性。本研究中GO分析顯示，Hsa-miR-1的靶基因可能參與細胞形成過程的代謝和調(diào)控，通路分析表明其靶基因集合顯著富集在癌癥通路、與癌癥發(fā)生相關的信號通路以及心肌通路中。提示HsamiR-1可能參與惡性腫瘤及心臟疾病的發(fā)生機制。

總之，Hsa-miR-1可能參與了食管癌的發(fā)病機制，其預測靶基因集合富集于多個生物學過程且顯著富集于癌癥通路;此為后續(xù)Hsa-miR-1生物學功能的研究奠定了基礎。

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