(山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，山東省罕少見病重點實驗室，濟南 250062)

人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)屬皰疹病毒β亞科，人類對其普遍易感，大多終身呈隱性感染或潛伏感染［1］。在孕婦，HCMV原發(fā)或復發(fā)感染均可引起新生兒宮內(nèi)感染或圍產(chǎn)期感染，導致胎兒畸形、先天性耳聾、智力低下和發(fā)育遲緩［2］;在免疫低下者(如器官、骨髓移植患者，艾滋病患者)，HCMV可導致高熱、白細胞減少、視網(wǎng)膜炎、肺炎、腦炎等嚴重疾?。?］。因此HCMV的早期檢測具有重要臨床意義。HCMV病毒顆粒包含至少33種結(jié)構(gòu)蛋白，其中以UL83編碼的低基質(zhì)磷酸化蛋白pp65含量最為豐富［4］。pp65蛋白是一種晚期結(jié)構(gòu)蛋白，在感染早、中、晚期均有表達，其在病毒復制晚期出現(xiàn)高表達是HCMV活動性感染的一項早期指標。通過pp65抗原血癥檢測病毒是否為活動性感染，是新近被廣泛接受的相對“金標準”。另外，pp65蛋白是 HCMV特異性細胞毒性T細胞(CTL)的最主要靶分子［5，6］，其既能誘導特異性抗體的產(chǎn)生，亦能誘導機體的細胞免疫應答，已成為疫苗研制和免疫治療的首選。2012年5月，我們利用大腸桿菌表達系統(tǒng)對pp65蛋白中抗原性強及特異性高的親水性片段(321aa-562aa)進行了表達、純化及初步抗原性鑒定，旨在為HCMV 檢測試劑盒的研制和疫苗的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 HCMV AD169病毒株(中國疾病預防控制中心病毒病所)，人胚肺成纖維(Human embryo lung，HEL)細胞、E.coli TOP10 菌株、PET30a(+)載體及BL21(DE3)菌株(均為本實驗室保存);pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶(大連寶生物工程公司)，1640培養(yǎng)基(GIBCO 公司)，D2000 DNA Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，DNA提取試劑盒、Taq酶、質(zhì)粒純化試劑盒及DNA凝膠電泳回收試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司］;其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 目的基因選擇及引物設計 查閱Genbank中HCMV AD169株pp65基因序列，選961～1 686 bp的片段321aa-562aa設計引物，在上游引物5'端引入NdeⅠ酶切位點(CATATG)，下游引物5'端引入XhoⅠ酶切位點(CTCGAG)，序列如下:P1(上游):5'-GGGAATTCCATATGATGAACGGGCAGCAGATCT-3'，P2(下 游):5'-CCGCTCGAGTCAACCTCGGTGCTTTTTGG-3'，引物由北京博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 HCMV DNA提取及目的基因擴增 常規(guī)培養(yǎng)HEL細胞，待細胞生長成單層后以感染復數(shù)量(M.O.I)＞5的HCMV接種細胞，待細胞病變達90%時收獲。棄培養(yǎng)上清，DNA提取試劑盒提取DNA并以其為模板擴增目的基因。PCR反應體系為25 μL，反應條件為94 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 1 min，30個循環(huán);72℃延伸10 min。取擴增產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA凝膠電泳回收試劑盒回收目的帶。

1.4 表達載體pET30a(+)-pp65構(gòu)建 將回收片段連接于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)菌株，提取質(zhì)粒做NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定并委托北京博尚生物技術(shù)有限公司測序。將片段與經(jīng)相同雙酶切的pET30a(+)質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)菌株。用PCR方法進行鑒定。

1.5 目的蛋白表達及純化 挑取PCR鑒定陽性菌落接種于5 mL K+LB培養(yǎng)液中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)16 h，以1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮K+LB培養(yǎng)液中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)至A600約為0.8，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)繼續(xù)37℃劇烈震蕩培養(yǎng)4 h，取1 mL菌液，4 000 r/min離心10 min收集菌體，加入去離子水和2×SDS蛋白凝膠加樣緩沖液各100 μL重懸，煮沸10 min，12 000r/min離心10 min;取上清液20 μL與蛋白Marker同時行十二烷基硫酸鈉—聚丙稀酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，考馬斯亮藍R250染色，脫色液脫色后觀察有無目的條帶。常規(guī)鎳柱法純化目的蛋白，SDS-PAGE電泳觀察蛋白純度，BCA法測定蛋白濃度。

1.6 目的蛋白純化及抗原性檢測 采用ELISA法。將純化的pp65蛋白用包被液稀釋，按25 ng/孔分別加入聚苯乙烯板孔中，同時包被全病毒抗原，飽和濕度4℃過夜;次日以20%山羊血清封閉，加入1∶100稀釋的HCMV陽性血清，同時做空白、陰性對照，37℃孵育1 h;洗凈甩干后加入1∶500稀釋的羊抗人IgM-HRP，37℃孵育1 h;洗凈甩干后加入TMB顯色液0.1 mL/孔，37 ℃10 min，加入終止液(2M H2SO4)0.1 mL，以空白對照孔調(diào)零后采用酶標儀測各孔A450，P/N≥2.1即為陽性(P代表試驗孔A值，N代表陰性對照孔A值)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴增 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后在726 bp處獲得特異性條帶，與預期目的基因大小一致(圖1)。測序結(jié)果與目的基因序列符合率達99%，其中第13位C突變?yōu)锳，氨基酸由Gln突變?yōu)長ys，第52位G突變?yōu)锳，氨基酸由Glu突變?yōu)長ys。經(jīng)蛋白質(zhì)分析軟件分析，突變氨基酸處于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，不影響其抗原性及親水性。

圖1 HCMV pp65的PCR產(chǎn)物

2.2 表達載體pET30a(+)-pp65的構(gòu)建與鑒定重組質(zhì)粒pET30a(+)-pp65經(jīng)雙酶切、凝膠電泳后，在726、5 422 bp獲得電泳帶，大小與目的基因及載體片段長度一致(圖2)。

2.3 目的蛋白表達 SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，含重組質(zhì)粒的誘導菌在相對分子質(zhì)量約為30 kD處出現(xiàn)一強蛋白條帶，而空載體菌在相應位置未出現(xiàn)該蛋白條帶(圖3)。

圖2 pET30a(+)-pp65酶切圖譜

圖3 目的蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.4 目的蛋白抗原性 pp65抗原和全病毒抗原的P/N 值分別為 2.737、2.535，證明表達的截短 pp65蛋白抗原性優(yōu)于全病毒抗原。

3 討論

機體初次感染HCMV后可受到宿主免疫控制，故大多數(shù)表現(xiàn)為臨床不顯性感染或潛伏感染，且伴隨終身。當機體免疫功能受損時，潛伏的病毒被激活、增殖可導致嚴重感染。HCMV由母嬰傳播可致新生兒神經(jīng)發(fā)育遲緩和其他先天性缺陷。因此對HCMV感染的早期診斷、預防和治療是眾多研究者關注的熱點。

pp65為HCMV的主要被膜磷蛋白，占被膜蛋白致密顆粒的95%，占整個病毒蛋白的15%。在HCMV AD169株的標準序列中，其編碼基因UL83位于119，352 ～121，037(互補鏈)，全長 1 686 bp，編碼561氨基酸。在不同的HCMV病毒株中，pp65具有高度的保守性，抗原決定簇變異較少［7］，主要參與病毒基因調(diào)節(jié)以及改變宿主細胞的代謝。

研究表明，pp65蛋白或其短肽段在體內(nèi)外均可誘導特異性細胞免疫應答［8］，而后者是顯示HCMV活動性感染的一項重要早期指標之一，對區(qū)分HCMV感染呈激活還是潛伏狀態(tài)有重要價值。因pp65刺激產(chǎn)生細胞免疫的能力較強，已成為目前用于制備疫苗的首選靶抗原。Beckman公司的科研人員構(gòu)建了包含HCMVpp65抗原表位的嵌合型融合肽段，在HLA-A*0201/κ(b)轉(zhuǎn)基因小鼠試驗中激發(fā)了強烈的CTL應答［9］。因而，本研究選擇HCMV AD169株pp65基因序列中抗原性強及特異性高的親水性片段(321aa-562aa)為研究對象，結(jié)果顯示PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后在726 bp處獲得特異性條帶，與預期目的基因大小一致;重組質(zhì)粒pET30a(+)-pp65經(jīng)雙酶切、凝膠電泳后，在726、5 422 bp獲得電泳帶，大小與目的基因及載體片段長度一致;含重組質(zhì)粒的誘導菌在相對分子質(zhì)量約為30 kD處出現(xiàn)一強蛋白條帶，而空載體菌在相應位置未出現(xiàn)該蛋白條帶;pp65抗原和全病毒抗原的P/N 值分別為 2.737、2.535。

綜上所述，本研究成功表達截短HCMV pp65抗原，并證實其蛋白抗原性優(yōu)于全病毒抗原;此為HCMV檢測試劑盒的研制和疫苗的研究提供了依據(jù)。

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