(河南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，鄭州 450002)

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate，MTHFR)是人類同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)代謝途徑的關(guān)鍵酶，其能催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸的還原反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因缺陷與心血管疾病發(fā)生有關(guān)［1］。MTHFR基因突變可導(dǎo)致酶活性降低，但除C677T位點(diǎn)外，人群中MTHFR基因突變發(fā)生頻率較低［2］。法洛四聯(lián)癥(TOF)是指肺動(dòng)脈狹窄、室間隔缺損、主動(dòng)脈騎跨及右室肥厚四種畸形并存的先天性心臟病(CHD)，約占全部CHD的10%，遺傳度為55%～65%，其中室間隔缺損和肺動(dòng)脈狹窄是CHD中最常見(jiàn)的兩種畸形。2011年4月，我們對(duì)MTHFR基因多態(tài)性與TOF的相關(guān)性進(jìn)行了分析，旨在進(jìn)一步尋找TOF的致病易感基因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 根據(jù)知情同意的原則，收集河南省胸科醫(yī)院和鄭州市兒童醫(yī)院經(jīng)臨床表現(xiàn)、彩色多普勒超聲心動(dòng)圖診斷的TOF患者136例為觀察組，男66例、女70例，年齡6個(gè)月～12歲;均排除心臟血管以外畸形，且染色體核型分析無(wú)異常。對(duì)照組為上述醫(yī)院同期經(jīng)臨床表現(xiàn)和心臟彩色超聲檢查排除CHD及其他心臟結(jié)構(gòu)畸形的住院患兒277例，男160例、女117例，年齡3個(gè)月～10歲。兩組一般資料具有可比性。

1.2 MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè) 兩組均抽取外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)-Na2抗凝，置－70℃冰箱中備用;利用常規(guī)飽和酚—氯仿抽提法從全血中提取基因組DNA，測(cè)定DNA純度和濃度后－20℃保存?zhèn)溆?。MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)步驟:①M(fèi)THFR-C677T引物:參照 Frosst等［3］的設(shè)計(jì)，上游引物5'-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3'，下游引物5'-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3'。②PCR 反應(yīng)體系:總體積 25 μL，其中 ddH2O 18.5 μL，10 × 緩沖液 2.5 μL，10 mM 的 dNTPs 1 μL，12.5 pmol/μL 的引物各 1 μL，DNA 1 μL。③PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58℃復(fù)性45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán);72℃終末延伸10 min，最后置于4℃保存。④酶切與酶切產(chǎn)物電泳:10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液1.0 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，限制性內(nèi)切酶 Hinf I 1 μL，組成12 μL 的酶切反應(yīng)體系，37℃消化酶切16 h，取出酶切產(chǎn)物。采用3%瓊脂糖凝膠電泳，85 V，45 min，最后在紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)酶切產(chǎn)物及大小，分析基因型。⑤測(cè)序分析:擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，結(jié)果采用ClustalX軟件與基因庫(kù)中野生型MTHFR基因序列進(jìn)行序列對(duì)比分析(基因序列號(hào):AY338232.1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件和Epi Info軟件對(duì)兩組MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型和等位基因頻率進(jìn)行比較，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Epi Infor2000軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 酶切及測(cè)序 PCR產(chǎn)物為198 bp，野生型677C/C不能被Hinf I酶切，純合突變型677T/T被Hinf I完全酶切為175 bp和23 bp兩個(gè)片段(其中23 bp片段由于太短而無(wú)法在凝膠上清楚顯示)，雜合型677C/T可部分被Hinf I酶切為198、175和23 bp三個(gè)片段(其中23 bp片段由于太短而無(wú)法在凝膠上清楚顯示)，見(jiàn)圖1。3種基因型通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)準(zhǔn)確，見(jiàn)圖2。

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)情況 兩組MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說(shuō)明群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來(lái)自同一孟德?tīng)柸后w。見(jiàn)表1、2。

圖1 MTHFR基因多態(tài)性酶切電泳圖

圖2 MTHFR基因C677T多態(tài)性位點(diǎn)3種不同基因型測(cè)序結(jié)果

表1 對(duì)照組MTHFR基因多態(tài)性位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn)

表2 觀察組MTHFR基因多態(tài)性位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn)

2.3 MTHFR基因型構(gòu)成 觀察組共檢測(cè)出MTHFR基因純合突變53例(39%)，雜合突變60例(44%)，正?；蛐?3例(17%);觀察組純合型TT突變頻率高于對(duì)照組，P＜0.05(χ2=11.89);T等位基因攜帶者患TOF的風(fēng)險(xiǎn)高于C等位基因攜帶者(OR=0.553，95%CI為 0.412 3 ～0.741 4)，見(jiàn)表3。

表3 兩組MTHFR基因型構(gòu)成比較［例(%)］

3 討論

TOF是最常見(jiàn)的紫紺型CHD，是胚胎期動(dòng)脈干與心球分隔不均而導(dǎo)致的心臟流出道畸形。目前研究結(jié)果顯示，心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞在分化為心臟流出道細(xì)胞時(shí)若處于高濃度的Hcy環(huán)境中，就會(huì)改變凋亡相關(guān)基因表達(dá)，從而不能完成心臟流出道細(xì)胞心肌化過(guò)程，導(dǎo)致心臟畸形［4］。MTHFR是一種黃素蛋白，由MTHFR基因編碼。研究發(fā)現(xiàn)，人體MTHFR基因存在29種突變，其中最常見(jiàn)的為C677T突變，即677位核苷酸C→T(丙氨酸→纈氨酸)點(diǎn)突變。這種錯(cuò)義突變使酶的耐熱性和活性均降低，可使血漿Hcy水平升高達(dá)3倍以上，導(dǎo)致中高度Hcy血癥。Hcy可選擇性作用于神經(jīng)外胚層的特定部位，影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化、遷移、增殖。

本研究顯示，兩組413例樣本中檢測(cè)得到的MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與SNP數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道一致(http://www.ncbi.nln.nih.gov/SNP/)，其中觀察組純合型TT突變頻率和等位基因頻率顯著高于對(duì)照組。提示MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與TOF存在相關(guān)性，即具有T等位基因的個(gè)體罹患TOF的風(fēng)險(xiǎn)增高。而Lee等［5］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MTHFR基因多態(tài)性與CHD無(wú)相關(guān)性，特別是TOF。造成上述結(jié)果差異的可能原因如下:①M(fèi)THFR基因突變導(dǎo)致的Hcy水平變化與體內(nèi)葉酸水平也存在相關(guān)性。雖然Hcy是一種損害心血管發(fā)育的危險(xiǎn)因素，但是葉酸能有效拮抗Hcy的發(fā)育毒性［6］。有充足葉酸攝入且無(wú)其他半胱氨酸代謝酶缺陷時(shí)，即使存在MTHFR基因突變，Hcy水平也可無(wú)變化;葉酸供應(yīng)缺乏時(shí)，MTHFR基因突變則可引起Hcy水平升高［7］。因此，不同地區(qū)、種族、人群及葉酸攝入量的差異將影響到相關(guān)疾病的發(fā)生，在下一步研究中應(yīng)對(duì)這些與MTHFR基因突變相關(guān)的因素應(yīng)進(jìn)行重點(diǎn)分析。②上述實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)不同。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的PCR酶切電泳和直接測(cè)序兩種方法相對(duì)比的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，減少了MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型分析的誤差。另外，筆者認(rèn)為還應(yīng)在TOF患者中進(jìn)行MTHFR基因突變篩查和表達(dá)分析，以期更深入了解其在TOF發(fā)生中的作用。

總之，MTHFR基因 C677T位點(diǎn)基因突變與TOF存在相關(guān)性，其可能是TOF的易感基因，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行深入研究。

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