朱 莉，王彥亮，黃志鋒，何 帥，周稚輝，麻健豐

(1溫州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，浙江溫州 325027;2溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;3解放軍第118醫(yī)院)

細胞外機制(ECM)是由纖維性蛋白質(zhì)、氨基多糖和蛋白聚糖等生物大分子組成的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在維持生物結(jié)構(gòu)的完整性、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞表型、功能的調(diào)節(jié)中均具有重要作用。串珠素是ECM中主要的蛋白聚糖成分，廣泛存在多種組織基底膜和軟骨基質(zhì)中，與其他基質(zhì)成分緊密結(jié)合并自行組成二聚體和其他的大聚合物。大量體外研究發(fā)現(xiàn)，串珠素在細胞生長和分化、組織化等方面發(fā)揮多種功能，可以通過調(diào)節(jié)生長因子的結(jié)合和活性，影響血管壁細胞、軟骨和骨細胞等多種細胞在發(fā)育期的增殖、遷移，并影響細胞與基質(zhì)的黏附，在機體心血管系統(tǒng)和軟骨發(fā)育，血管、骨骼系統(tǒng)和神經(jīng)肌接頭(NMJ)的生成與功能調(diào)控等多種生命過程中均具有重要作用。2010年5月～2011年12月，我們對串珠素基因片段進行克隆、擴增和蛋白表達，以獲取串珠素蛋白，并探討其在咀嚼肌中的表達特點。

1 材料與方法

1.1 材料 探針載體直接轉(zhuǎn)化，擴增，酶切，測序后，酶切片段，插入pET32a，表達，測序，表達全菌蛋白，Wetstern blot 1—測 his，Western blot 2—測抗串珠素，2次均在同一分子量處發(fā)現(xiàn)表達。牛串珠素基因(b串珠素)探針為Ray Rodgers教授(Reproductive Medicine Unit，Obstetrics ＆ Gynaecology，Adelaide University，SA，AUSTRALIA，5005)惠贈，全長183 bp，連接于pGEM-T Easy載體。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因擴增和鑒定 用b串珠素-pGEMT Easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(質(zhì)粒0.1 μg，DH5α 感受態(tài)菌200 μL，冰浴30 min后42 ℃熱休克90 s，)，涂布于(含 Amp 100 μg/mL)的 LB 平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑陽性菌，將陽性細菌在含Amp的瓊脂培養(yǎng)基中劃板，挑取單克隆菌落接種于含Amp LB培養(yǎng)液中37℃振蕩過夜。擴增后，用堿裂解法提取質(zhì)粒，酚/氯仿抽提回收質(zhì)粒，EcoR I+Sal I酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，并送DNA測序。

1.2.2 目的基因克隆和表達 將測序正確的串珠素片段插入到表達載體 pET32a中(DNA片段2.5 μL，載體 2.5 μL，0.1 M MgCl20.5 μL，Sal I 5 μL，16℃，4 h)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，接種于AMP+LB平板。37℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落接種于LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)4 h?；厥召|(zhì)粒，酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。DNA測序鑒定。鑒定正確后，挑選1%轉(zhuǎn)化后的細菌接種在新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，0.2 mM IPTG誘導(dǎo)4 h，收菌，SDS-PAGE分析鑒定。以pET32a空載體轉(zhuǎn)化和未經(jīng)誘導(dǎo)的細菌設(shè)為對照組。

1.2.3 融合蛋白表達檢測 采用Western blot法。表達全菌蛋白SDS-PAGE，200 mA低溫轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉封閉1 h后，鼠抗His抗體(1∶1 000)4℃封閉過夜。PBST(PBS中加入0.1%Tween-20)洗膜3次，每次10 min;羊抗鼠二抗(1∶5 000)封閉1 h;PBST洗膜3次，每次10 min;PBS洗膜3次，每次5 min;發(fā)光，顯影。陰性對照為pET32a誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)菌蛋白。再次行Western blot，一抗采用鼠抗串珠素單抗，檢測融合蛋白表達情況。陰性對照仍然設(shè)為pET32a誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)菌蛋白。

1.2.4 b串珠素抗血清制備 對雄性新西蘭家兔進行常規(guī)體檢，將重組的串珠素核心蛋白500 μg用PBS稀釋至1 mL，與等體積的Freund完全佐劑充分乳化后，在家兔皮下注射1 mL，7 d后再次在雙后腿淋巴結(jié)內(nèi)注射100 μg抗原以加強免疫。以后每隔10 d進行一次加強免疫，5 W后取家兔全血，4℃過夜，4 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集血清，－20 ℃保存。配置0.1 g/L瓊脂糖凝膠，行雙向免疫擴散試驗，測定抗體滴度。

1.2.5 免疫組化實驗 將成年大鼠脫頸處死，立即取材面部咀嚼肌，多聚甲醛固定過夜，梯度酒精脫水，石蠟包埋，5 μm石蠟切片。串珠素多克隆抗體工作濃度為1∶100，二抗為羊抗兔IgG(SABC免疫組化試劑盒，博士德公司，武漢)，工作濃度為1∶100。切片脫蠟至水，在室溫下用H2O2處理30 min，PBS洗5 min×2次，胰蛋白酶消化37℃ 30 min，PBS洗5 min×3次，50 mL/L正常羊血清封閉10 min，PBS洗5 min×3次。加一抗，對照組用正常羊血清代替一抗，4℃過夜。PBS洗5 min×3次，加二抗，37℃30 min。PBS洗5 min×3次，加SABC 37℃ 30 min。PBS洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片，光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 串珠素擴增和插入到表達載體后酶切電泳質(zhì)粒擴增后酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示在100～200 bp間有新條帶出現(xiàn)(見圖1)(DNA marker:SD012)。擴增后所獲得的片段送DNA測序(寶泰克公司)，測序結(jié)果與原序列相同，說明擴增正確。將測序正確的串珠素片段插入到表達載體pET32a中，EcoR I+Sal I酶切后電泳鑒定，在100～200 bp處有穩(wěn)定電泳條帶出現(xiàn)，顯示串珠素片段插入到pET32a中的連接反應(yīng)正確(DNA marker:DGL2000，見圖2)。

圖1 b串珠素擴增后酶切電泳圖

圖2 串珠素片段插入到表達載體pET32a后酶切電泳圖

2.2 串珠素蛋白表達和分析 SDS-PAGE顯示在IPTG誘導(dǎo)的串珠素-pET32a轉(zhuǎn)化菌蛋白有新條帶出現(xiàn)，新條帶的分子量在35 kD附近，說明IPTG誘導(dǎo)下插入pET32a的串珠素可以進行高效的蛋白表達。對照組分別為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的串珠素-pET32a轉(zhuǎn)化菌和用pET32a空載體的轉(zhuǎn)化菌蛋白。Western blot示，未誘導(dǎo)的菌無表達，而融合蛋白的和pET32a轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)后均有蛋白表達，其中融合蛋白條帶相對分子質(zhì)量大于pET32a誘導(dǎo)的蛋白條帶，說明插入pET32a載體的蛋白成功表達(見圖4)。

圖3 SDS-PAGE分析串珠素表達

圖4 Western blot顯示的融合蛋白表達

2.3 免疫組化染色結(jié)果 光鏡下觀察，串珠素在咀嚼肌中表達顯著，均勻分布在骨骼肌肌纖維細胞外的基質(zhì)中，尤其在肌膜處明顯聚集呈帶狀分布(圖5)。

圖5 串珠素在骨骼肌中的分布

3 討論

串珠素是ECM中主要的蛋白聚糖之一［1］，分子量約為700 kD，由核心蛋白和4條硫酸肝素(HS)側(cè)鏈組成，與其他基質(zhì)成分緊密結(jié)合并自行組成二聚體和大的聚合物。串珠素主要存在于骨、軟骨、血管、牙胚中，介導(dǎo)著細胞增殖分化及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［2，3］。組織來源不同的串珠素硫肝素側(cè)鏈不同，不同種屬的哺乳動物類串珠素核心蛋白序列上有同源性，不同組織細胞來源的串珠素側(cè)鏈結(jié)構(gòu)差別較大，側(cè)鏈的變化對于其生物學(xué)活性具有明顯的影響。串珠素側(cè)鏈的HS帶有負電，通過其吸水性增加組織的容積，可以結(jié)合、釋放生長因子，使生長因子暫時失活，并在必要時恢復(fù)其活性，不僅具有生長因子儲存庫的作用，也是細胞黏附分子的重要配體。

骨骼肌再生是一個至今仍未完全被理解的過程，運動神經(jīng)與骨骼肌間建立突觸連接的位置是運動神經(jīng)與肌細胞相互誘導(dǎo)來確定的，長期以來肌纖維周圍的基膜一直被認(rèn)為是這種調(diào)控作用的重要因素，但具體機制了解較少。近年來，隨著對NMJ中ACh受體(AChR)復(fù)合體研究的深入，揭示出基膜中的多種硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)在此過程中起主導(dǎo)作用。運動神經(jīng)末梢通過釋放的神經(jīng)遞質(zhì)可誘導(dǎo)突觸后膜上信號蛋白的積聚，使AChR復(fù)合體定位在突觸后膜上，其中串珠素是該過程中最重要的一種信號蛋白，被認(rèn)為是AChR復(fù)合體在運動終板突觸后膜上定位的信號分子［4］。串珠素在NMJ處高表達，是NMJ處乙酰膽堿酯酶(AChE)的獨特受體分子，在把AChE定位在突觸基膜上的過程中發(fā)揮主要的作用［5］。AChE復(fù)合體在突觸后膜的定位是通過串珠素結(jié)合AChE和dystroglycan來達到的［6］。體外實驗已證實，在運動神經(jīng)—肌肉共培養(yǎng)模型中，串珠素的存在能夠明顯促進二者間的相互誘導(dǎo)生長及突觸的形成。在NMJ形成后，串珠素還繼續(xù)對維持突觸的穩(wěn)定發(fā)揮作用［7］。同時，串珠素還參與了骨骼肌再生過程中的復(fù)雜的調(diào)控機制，因其是細胞表面和ECM的主要成分，調(diào)控生長因子活性并影響細胞生長和分化［8］。

骨骼肌損傷后，變性的肌纖維釋放出多種信號，浸潤的炎細胞和重塑的ECM均能影響修復(fù)性肌形成的過程。在多種信號存在的情況下，衛(wèi)星細胞活化、肌前體細胞的增生和分化等一系列過程都需要密切調(diào)控。Casar等［9］報道了注射氯化鋇誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠骨骼肌細胞再生過程中觀察的HSPG表達情況，發(fā)現(xiàn)有幾種HSPG出現(xiàn)暫時性上調(diào)，包括syndecan-3、glypican、串珠素和syndecan-4。這些HSPG的表達增加與分化過程中早期標(biāo)志物的表達相一致，并定位于新形成的肌管中。對缺血或毒性損傷，新形成的肌纖維在最初的基膜管中發(fā)育，這樣可以讓NMJ在原來的突觸位置形成。這種基膜位置信息的儲存依賴于HSPG，如agrin或串珠素。串珠素、glypican、syndecan-3和 probably syndecan-4是伴隨新形成的正在分化的肌管能被原位檢測到的幾種主要HSPG。體外結(jié)合試驗證實，ECM組蛋白H1能特異性結(jié)合串珠素，二者共同存在于再生的骨骼肌中，包括肌管培養(yǎng)基和再生骨骼肌的ECM。組蛋白H1與串珠素結(jié)合能顯著刺激成肌細胞的增生［10］。

本實驗設(shè)計通過基因工程方法表達串珠素核心蛋白，并制備特異性多克隆抗體，用以檢測串珠素在咀嚼肌等口腔組織中的表達和分布。本研究首先完成了對b串珠素基因的正確克隆和表達，建立了可以表達b串珠素的組織工程菌。pET32a載體上串珠素插入?yún)^(qū)的上游有His蛋白的表達序列，可作為在Western blot中檢測pET32a表達的標(biāo)記。在以鼠抗His抗體作為一抗進行Western blot檢測時，融合蛋白的和pET32a轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)后均有蛋白表達，其中融合蛋白條帶相對分子質(zhì)量大于pET32a誘導(dǎo)的蛋白條帶;而在以鼠抗串珠素為一抗進行Western blot檢測中，只有融合蛋白轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)后有蛋白表達，證明串珠素-pET32a轉(zhuǎn)化菌蛋白能表達串珠素，并能與鼠抗串珠素特異性結(jié)合。

本實驗通過條件誘導(dǎo)方法實現(xiàn)了串珠素核心蛋白的原核表達，而其較復(fù)雜的蛋白糖基化過程需要通過真核動物細胞表達來實現(xiàn)。用anti-串珠素單抗進行的Western blot表明原核表達的串珠素核心蛋白具有天然串珠素的免疫原性。因此本實驗的方法僅是利用其具有的免疫原性來實現(xiàn)抗體制備，而不能用來產(chǎn)生活性蛋白。免疫沉淀實驗證明了用其制備的多克隆血清可對串珠素核心蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合。另外，免疫組化實驗表明牛與鼠串珠素的免疫原性之間存在交叉，應(yīng)為哺乳動物間串珠素序列的同源性所致。

串珠素通過參與基底膜成分的結(jié)合與組裝，對于維持基底膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性發(fā)揮著極其重要的作用。串珠素廣泛表達在咀嚼肌的ECM中，其中在肌膜等ECM的膜性結(jié)構(gòu)中更是集中表達。

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