王玉梅，劉永平，曹 凱，秦博文，商亞珍

(河北省重要研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北 承德 067000)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害引起的癡呆綜合征，包括缺血性腦血管病、出血性腦血管病以及急性或慢性缺氧性腦血管病引起的癡呆，是老年期癡呆病中最常見的類型之一［1］。嚴(yán)重影響患者的身心健康，給家庭、社會(huì)造成了沉重負(fù)擔(dān)。隨著醫(yī)藥工作者對(duì)VD的認(rèn)識(shí)和研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)興奮性氨基酸及其受體的激活以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生成都與VD的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)［2］。引起神經(jīng)元死亡的興奮性毒性理論已成為腦缺氧缺血性損傷的主要學(xué)說，而VEGF促進(jìn)血管的生成對(duì)腦缺血后血管重建及神經(jīng)功能的恢復(fù)起重要作用。

黃芩莖葉黃酮(Scutellaria baicalensis Georgi stem flavonoids，SSF)是從中藥黃芩地上部分提取分離的黃酮類化合物，其多羥基結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)神經(jīng)損傷有很好的保護(hù)作用。我們的前期工作已經(jīng)證明SSF具有抗炎、抗氧化、抗缺氧和改善記憶障礙等作用［3－6］。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型，探討SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬細(xì)胞中N－甲基－D－天門冬氨酸受體(N－methyl－D－aspartate receptor，NMDAR)和皮層細(xì)胞中VEGF表達(dá)的影響。

材料和方法

1 動(dòng)物和試劑

健康雌性SD大鼠60只(購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)為90912)，300～320 g;SSF由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所制備;引物由上海生工公司合成，NMDAR1(498 bp)上游引物5'－GCAGTAAACCAGGCCAATAAGCG －3'，下游引物5'－CTCCATCAGCAGAGCCGTCACAT－3';NMDAR2A(459 bp)上游引物5'－TGGAGATGACACGGACCAGGAG －3'，下游引物 5’－AAATCATAGCCAGTGAGGCCGAG－3';NMDAR2B(314 bp)上游引物 5’－GAACGAAACTGACCCAAAGAGC－3'，下游引物 5’－CAGGGAA GTAGGTGGTGACGAT－3';VEGF(462 bp)上游引物5'－CTGTACCTCCACCATGCCAAG －3'，下游引物5'－ACAAGGCTCACAGTGAACGC－3';β－actin(207 bp)上游引物 5'－CACCCGCGAGTACAACCTTC －3'，下游引物 5'－ CCCATACCCACCATCACACC － 3';TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(100次量)購于大連寶生物工程有限公司。

2 大鼠慢性腦缺血模型制備

大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，頸內(nèi)部去毛、強(qiáng)力碘消毒后沿頸正中切開，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并套以“0”號(hào)線。待動(dòng)物清醒后結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。術(shù)前稱重并腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行麻醉。術(shù)中保證大鼠能自主呼吸，術(shù)后每只動(dòng)物腹腔注射8×104U青霉素鈉預(yù)防細(xì)菌感染。待大鼠完全清醒后送至溫度為22℃ ±1℃的動(dòng)物房飼養(yǎng)，觀察;做同樣手術(shù)操作但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈作為假手術(shù)組。術(shù)后30 d利用水迷宮進(jìn)行模型篩選，成模率為75%。在手術(shù)后第35 d，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組:模型組，17.5 mg·kg－1·d－1、35 mg·kg－1·d－1和 70 mg·kg－1·d－1SSF 3個(gè)劑量給藥組，每組8只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)灌胃給藥38 d后取材，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

3 腦組織細(xì)胞中 NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B和VEGF的檢測(cè)

采用RT－PCR法檢測(cè)海馬細(xì)胞中 NMDAR1 mRNA、NMDAR2A mRNA、NMDAR2B mRNA和皮層細(xì)胞中 VEGF mRNA的含量。各組大鼠在術(shù)后72 d，末次灌胃給藥60 min后，乙醚麻醉，斷頭冰上取腦，分離海馬和皮層并保存于－80℃冰箱中。分別提取海馬和皮層細(xì)胞中RNA，用DU800紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。嚴(yán)格按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0 試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠于紫外透射儀中確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物并攝取圖像。利用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以目的條帶的吸光度值與β－actin條帶吸光度值的比值，作為各目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬細(xì)胞中 NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎2個(gè)月可使大鼠海馬細(xì)胞中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B的mRNA表達(dá)明顯增加，灌胃給予 SSF 17.5 mg·kg－1·d－1、35 mg·kg－1·d－1和70 mg·kg－1·d－1治療38 d可不同程度降低大鼠海馬細(xì)胞中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B mRNA的表達(dá)。與假手術(shù)組相比，慢性腦缺血大鼠海馬中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B mRNA的表達(dá)分別增加了75.86%、75.68% 和84.14%(P＜0.01);而3個(gè)劑量SSF可不同程度地降低NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B mRNA的表達(dá)，分別降低了10.48%、7.92% 和 13.04%(17.5 mg·kg－1SSF，P ＜0.05)，28.43%、26.09%和 28.67%(35 mg·kg－1SSF，P ＜0.01)，36.24%、39.72% 和 39.80%(70 mg·kg－1SSF，P ＜0.01)，見圖1。

2 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠皮層細(xì)胞中VEGF表達(dá)的影響

皮層細(xì)胞中VEGF的RT－PCR結(jié)果顯示，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎2個(gè)月可使大鼠皮層中VEGF mRNA的表達(dá)增加了18.57%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。灌胃給予SSF 17.5 mg·kg－1·d－1、35 mg·kg－1·d－1和70 mg·kg－1·d－1治療38 d可不同程度增強(qiáng)慢性腦缺血模型組大鼠皮層中VEGF mRNA的表達(dá)，分別增加了11.95%(17.5 mg·kg－1SSF，P＜0.05)、16.70%(35 mg·kg－1SSF，P ＜0.01)和 33.09%(70 mg·kg－1SSF，P ＜0.01)，見圖2。

討 論

Figure 1.The expression of NMDAR1，NMDAR2A and NMDAR2B mRNA in hippocampus of chronic cerebral ischemia rats.M:marker..n=6.##P＜0.01 vs sham group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group.圖1 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬細(xì)胞中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B表達(dá)的影響

Figure 2.The expression of VEGF mRNA in hippocampus of chronic cerebral ischemia rats.M:marker..n=6.##P＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.圖2 SSF對(duì)慢性腦缺血大鼠皮層細(xì)胞中VEGF表達(dá)的影響

中樞內(nèi)的興奮性氨基酸是維持正常腦功能，包括學(xué)習(xí)、記憶、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和發(fā)育等所必需的，如果含量過高，會(huì)作為一種神經(jīng)毒素引起神經(jīng)細(xì)胞腫脹和空泡變性，甚至導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡［7］。近年來，引起神經(jīng)元死亡的興奮性毒性理論已成為腦缺氧缺血損傷的主要學(xué)說。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元之間的信息傳遞通過突觸來完成。在突觸前神經(jīng)元所釋放的不同神經(jīng)遞質(zhì)的作用下，引起突觸后神經(jīng)元或去極化使其興奮，或超極化使其抑制［8］。興奮性氨基酸(excitatory amino acid，EAA)是腦內(nèi)含量最高且能使神經(jīng)元興奮的一類酸性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)，包括天門冬氨酸和谷氨酸兩種，與之相對(duì)應(yīng)的受體分為兩大類，離子型EAA受體和代謝型EAA受體。離子型EAA受體包括NMDA受體、α－氨基－3－羥基－5－甲基－4－異噁唑－丙酸受體和海人酸受體［9］。NMDA受體是目前研究最為深入的興奮性氨基酸受體，也是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的EAA受體之一，參與中樞神經(jīng)許多重要的病理生理過程［10－11］。NMDA受體是一種對(duì) Ca2+高度通透的配體電壓門控鈣離子通道受體，現(xiàn)已克隆出兩類NMDA受體的亞單位，一類為 NMDAR1(NR1)，一類為NMDAR2(NR2);NMDAR2又分為 NMDAR2A、NMDA2B、NMDAR2C和NMDAR2D四個(gè)亞基，各亞基在不同區(qū)域表達(dá)有所不同。NR1和NR2A分布廣泛，NR2B主要存在于前腦，NR2C多居于小腦，NR2D含量相對(duì)較少［12］。NR1是功能亞單位，它自身或與NR2亞單位聚合形成的通道復(fù)合體都具有NMDA受體的全部功能特性，而NR2是調(diào)節(jié)亞單位，它本身不具有NMDA受體的功能活性，但與NR1聚合共表達(dá)時(shí)可影響NR2的功能活性。要形成有功能的NMDA受體通道，需要組合NR1及NR2亞單位中的一個(gè)亞基。新生鼠海馬以NR2B和NR1 mRNA表達(dá)為主，NR2A mRNA水平很低，此后NR2A隨著發(fā)育持續(xù)增長。成年大鼠海馬中以NR1/NR2B/NR2A三聚體的NMDA受體復(fù)合物形成最多，而NR1/NR2B和NR1/NR2A含量次之［13］。研究表明，NMDA受體與突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)損傷、癲癇狀態(tài)、老年性癡呆癥等密切相關(guān)［14］。在正常靜息情況下，NMDA受體的離子通道內(nèi)存在Mg2+，能阻斷Ca2+內(nèi)流。該受體的激活至少需要3個(gè)信號(hào):甘氨酸與NMDA受體結(jié)合，谷氨酸與NMDA受體結(jié)合，膜去極化。在病理情況下，如缺血/缺氧、低血糖和持續(xù)性抽搐等，細(xì)胞外谷氨酸就會(huì)增加，可達(dá)正常的數(shù)倍至幾十倍，突觸間隙過度增加的谷氨酸刺激谷氨酸受體，啟動(dòng)一系列神經(jīng)細(xì)胞損害的病理生化反應(yīng)，其中包括兩個(gè)明顯不同的過程:一是由非NMDA受體過度興奮所介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞急性滲透性腫脹，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生，以Na+內(nèi)流，隨即Cl－和H2O被動(dòng)內(nèi)流為特征;二是由NMDA受體過度興奮所介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞遲緩性損傷，可于數(shù)小時(shí)至數(shù)日發(fā)生，以 Ca2+內(nèi)流為特征［15］。并能導(dǎo)致蛋白酶、核酸內(nèi)切酶的激活、NO的生成、自由基的產(chǎn)生以及線粒體膜滲透性的改變，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡。因此，NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性在缺血性腦損傷中起關(guān)鍵作用［16］。劉永等［17］研究證明NMDA受體活性的持續(xù)上調(diào)，將導(dǎo)致胞外Ca2+大量持續(xù)內(nèi)流，引起胞內(nèi)Ca2+超載，激活多種蛋白激酶，并進(jìn)一步導(dǎo)致受體上調(diào)，最終引起遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。本實(shí)驗(yàn)采用RT－PCR法檢測(cè)海馬細(xì)胞中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎2個(gè)月后，模型組大鼠海馬細(xì)胞中NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B mRNA的含量均顯著上升，而SSF 3個(gè)藥物組治療38 d，能不同程度地降低模型組大鼠海馬細(xì)胞中NMDAR1 mRNA、NMDAR2A mRNA和NMDAR2B mRNA的含量，從而減少興奮性氨基酸與受體結(jié)合產(chǎn)生的毒性作用，減輕腦缺血損傷。

缺血缺氧可造成不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)損害，保護(hù)腦免于損害機(jī)制之一是增加和改善腦的血流，而新生血管形成則有助于增加組織供血和供氧，對(duì)抗缺血缺氧和促進(jìn)組織修復(fù)。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，VEGF與腦組織缺血損傷密切相關(guān)，腦缺血在一定時(shí)間內(nèi)，腦組織通過血管新生代償性地促進(jìn)神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)。在正常腦組織中僅有少量VEGF蛋白表達(dá)，在腦缺血發(fā)生時(shí)，缺血、低氧作為一種信號(hào)激活VEGF/VEGFR系統(tǒng)，促使VEGF蛋白表達(dá)升高，特別在海馬、皮質(zhì)對(duì)缺血敏感的神經(jīng)元［18］。近年陸續(xù)報(bào)道，VEGF不僅可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、促進(jìn)微血管的形成，還能直接作用于多種類型的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)保護(hù)作用［19－20］。在本實(shí)驗(yàn)中，腦缺血模型組大鼠和SSF 3劑量藥物組大鼠腦組織中VEGF蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組增加，且SSF 3劑量藥物組VEGF蛋白表達(dá)又較腦缺血模型組明顯增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠腦缺血88 d，腦缺血作為一種刺激信號(hào)，可代償性地促進(jìn)VEGF的生成，反饋調(diào)節(jié)慢性腦缺血引起的神經(jīng)損傷，而3劑量SSF能夠進(jìn)一步促進(jìn)VEGF的蛋白表達(dá)，增加神經(jīng)組織中VEGF的水平，增加血管通透性，促進(jìn)血管生成，建立側(cè)支循環(huán)，從而恢復(fù)神經(jīng)營養(yǎng)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合以往的研究工作，SSF多羥基結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的還原性，可通過自身氧化，降低膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保證細(xì)胞膜的完整性和通透性;降低有慢性腦缺血引起的NMDA受體的含量，減少了興奮性氨基酸與NMDA受體的結(jié)合，降低了鈣通道開放，降低了由于鈣離子內(nèi)流而引起的細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而降低了神經(jīng)興奮性毒性引起的神經(jīng)損傷。同時(shí)SSF還能增強(qiáng)腦缺血大鼠腦內(nèi)VEGF的蛋白表達(dá)，促進(jìn)血管新生，建立側(cè)支循環(huán)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)損傷。提示SSF對(duì)缺血性神經(jīng)損傷的保護(hù)作用源于對(duì)腦內(nèi)NMDA受體和血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達(dá)的正向調(diào)節(jié)作用，該作用有利于SSF對(duì)VD的治療。

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