張新杰，劉建坤，高冬梅，張怡梅，朱鐵年△，趙瑞景

(1白求恩國際和平醫(yī)院腫瘤科，河北 石家莊 050082;2邯鄲市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 邯鄲 056001;3河北醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目前，全球糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率不斷增加，其慢性并發(fā)癥是致盲、致殘、致死的主要原因。據(jù)統(tǒng)計超過1/3的DM患者會發(fā)生并發(fā)癥，而且超過70%DM患者死于糖尿病血管病變［1］。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制尚未完全闡明，近年來氧化應(yīng)激在其發(fā)病中的作用越來越受到重視。本研究旨在探討抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)對糖尿病腎臟的保護作用及機制。

材料和方法

1 材料

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)及PDTC均購于Sigma;兔抗誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和鼠抗硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)抗體購于Santa Cruz;PV6001試劑盒、PV6002試劑盒和DAB顯色劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;快速血糖儀購于強生公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutases，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH－Px)測定試劑盒購于南京建成生物科技公司。清潔級雄性Wistar大鼠37只，體重180～210 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)動物中心［許可證號(冀)2008－1－003，批號為 901010］。高脂飼料參照Reed等［2］報道的配方自行配制，其中普通飼料熱量組成比值為:碳水化合物占65.5%，脂肪占10.3%，蛋白質(zhì)占24.2%。高脂飼料熱量組成比值為:碳水化合物占39%，脂肪占42%，蛋白質(zhì)占18%，其中脂肪主要為熟豬油和蛋黃粉。

2 方法

2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立 參照Reed等［2］方法建立2型糖尿病大鼠模型。所有大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為2組:正常對照組12只，高脂飲食組25只，分別給予普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)。2組大鼠均自由飲水?dāng)z食，晝夜周期12 h，室溫控制在(24±4)℃，每周觀察大鼠體重、血糖變化。喂養(yǎng)8周后，高脂組按27 mg/kg體重一次性腹腔注射STZ，72 h后測血糖值，以隨機血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠造模成功，共成模24只。將成模大鼠隨機分為2組，糖尿病模型組12只，PDTC治療組12只。PDTC治療組大鼠腹腔注射PDTC(50 mg·kg－1·d－1)，正常對照組、糖尿病組大鼠每天給予同體積的生理鹽水腹腔注射。治療1周后，禁食12 h，斷頭處死，留取血漿及腎臟組織進行相關(guān)指標檢測。

2.2 血糖測定 采用快速血糖儀測定。

2.3 腎皮質(zhì)勻漿中MDA含量、SOD和 GSH－Px活性的測定 取組織塊，稱重，放入玻璃勻漿管中，加入預(yù)冷的生理鹽水，生理鹽水的量是組織重量的9倍，充分勻漿10 min左右，低溫離心機3000r/min離心10～15 min，留上清棄沉淀，然后嚴格按照試劑盒說明書分別測定SOD和GSH－Px的活性和MDA含量。

2.4 尿微量白蛋白/肌酐的測定 PDTC治療結(jié)束后，收集尿液，使用國產(chǎn)深圳邁瑞B(yǎng)S－120全自動生化分析儀測定尿微量白蛋白/肌酐比值。

2.5 腎臟HE和Masson染色 取腎皮質(zhì)用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后切片，分別進行HE和Masson染色，光鏡下觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變。

2.6 電鏡觀察大鼠腎臟組織超微結(jié)構(gòu)變化 取1 mm×1 mm×1 mm大小腎皮質(zhì)，經(jīng)前固定、漂洗、后固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色等步驟，于日立H－7500透射電鏡下觀察并拍照。

2.7 免疫組化觀察大鼠腎臟組織iNOS和NT表達石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5 min×3次，抗原熱修復(fù)(120℃、2 min)，正常山羊血清封閉，室溫15 min，傾去血清，滴加Ⅰ抗(兔抗 iNOS 1∶100，鼠抗 NT 1∶60)，濕盒中4℃過夜，PBS洗5 min×3次，滴加山羊抗兔(或小鼠)IgG抗體 －HRP多聚體(PV6001、PV6002)，37℃孵育1 h，PBS洗5 min×3次，DAB 顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水終止反應(yīng);蘇木素復(fù)染，脫水，透明中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，細胞質(zhì)中棕黃色顆粒為陽性。數(shù)據(jù)處理:采用專業(yè)圖像分析軟件Image－Pro Plus 6.0進行處理。分別挑選高倍鏡視野下各組腎皮質(zhì)內(nèi)被染成棕黃色的區(qū)域作為測量區(qū)域，測得切片上陽性染色區(qū)域的吸光度值，每張切片分別隨機選取20個視野，測量吸光度，取其平均值，作為平均吸光度值，并以此代表實驗所研究腎皮質(zhì)內(nèi)iNOS和NT的表達強度進行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組空腹血糖比較

糖尿病模型(DM)組大鼠空腹血糖(26.55±7.10)mmol/L，與正常對照(NC)組(5.58 ±0.43)mmol/L相比明顯增高(P＜0.01);PDTC治療(DM+PDTC)組大鼠空腹血糖(11.55 ±2.89)mmol/L，與DM組相比明顯降低(P＜0.01)。

2 各組大鼠腎皮質(zhì)中SOD、GSH－Px活性和MDA含量比較

PDTC治療1周后，DM組大鼠的SOD和GSHPx活性均明顯低于 NC組(P＜0.01，P＜0.05);PDTC治療組大鼠的SOD和GSH－Px活性均明顯高于DM組，顯著差異(均P＜0.01)。DM組大鼠的MDA含量明顯高于NC組(P＜0.01);PDTC治療組MDA含量明顯低于DM組(P＜0.01)，見表1。

表1 各組大鼠腎皮質(zhì)MDA含量和SOD、GSH－PX活性比較Table 1.Comparison of MDA content，SOD and GSH － Px activity in the cortex of kidney in each group(.n=6)

表1 各組大鼠腎皮質(zhì)MDA含量和SOD、GSH－PX活性比較Table 1.Comparison of MDA content，SOD and GSH － Px activity in the cortex of kidney in each group(.n=6)

NC:normal control group;DM:diabetes group;DM+PDTC:PDTC－treated diabetes group;SOD:superoxide dismutase;GSH－ Px:glutathione peroxidase;MDA:malondialdehyde.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NC group;##P ＜0.01 vs DM group.

Group SOD［103U/(g protein)］GSH－Px(unit of activity)MDA［μmol/(g protein )］NC 188.73±1.49 2437.51±259.19 0.89±0.17 DM 71.50±3.01＊＊ 1667.32 ±81.16* 5.01 ±1.01＊＊DM+PDTC 161.00±2.55## 2392.78±174.01## 1.60±0.64##

3 各組大鼠尿微量白蛋白/肌酐的比較

PDTC治療1周后，DM組大鼠的尿微量白蛋白/肌酐明顯高于NC組，顯著差異(P＜0.01)，PDTC治療組大鼠的尿微量白蛋白/肌酐明顯低于DM組，顯著差異(P＜0.01)，見表2。

表2 各組大鼠尿微量白蛋白和尿肌酐的比較Table 2.Comparison of urine microalbumin and urine creatinine in each group(.n=6)

表2 各組大鼠尿微量白蛋白和尿肌酐的比較Table 2.Comparison of urine microalbumin and urine creatinine in each group(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NC group;##P ＜0.01 vs DM group.

NC 180.46 ±8.99 1525.09±221.86 1.97±0.40 DM 395.8 ±14.5＊＊ 3753.30±852.28* 5.05±0.70＊＊DM+PDTC 270.2 ±30.41## 2387.10±230.78## 3.65±0.36##

4 腎臟組織HE及Masson染色(膠原纖維染色)

HE染色光鏡下觀察，正常對照組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，毛細血管清晰;糖尿病模型組腎小球肥大，腎小球系膜基質(zhì)增多，可見部分腎小管上皮細胞空泡變性、萎縮、壞死;PDTC治療組較糖尿病模型組腎小管和腎小球損害減輕，見圖1A。Masson染色光鏡下觀察，糖尿病模型組腎小球肥大，膠原纖維染色綠染面積增多，纖維化明顯，球囊擴張明顯;PDTC治療組病理改變較糖尿病模型組明顯減輕，見圖1B。

Figure 1.Morphological changes of glomeruli in rat kidneys(×400).A:HE staining;B:Masson staining.圖1 大鼠腎臟組織HE和Masson染色觀察腎小球形態(tài)學(xué)變化

5 腎臟組織超微結(jié)構(gòu)改變

透射電鏡觀察腎皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)。正常對照組:基底膜正常無增厚，足細胞排列整齊，足突無融合;糖尿病模型組:基底膜高度增厚，厚度不均，有斷裂層，足突融合;PDTC治療組:基底膜輕度增厚，足突有輕度融合，病理改變較糖尿病模型組明顯減輕，見圖2。

Figure 2.Ultrastrcture of rat kidney cortex observed by transmission eletron microscopy(×20000).Rats in NC group exhibited normal podocyte ultrastructure，including ordered，upright podocyte foot processes(arrows).DM rats exhibited fusion of foot processes，variation of the width of the filtration slits，the broadening of foot processes with a reduction of the number of filtraion processes perunitlength，abd podocyte damage(arrows).PDTC －treated rats exhibited almost normal podocyte ultrastructure(arrows).圖2 透射電鏡觀察大鼠腎臟皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)

6 各組大鼠腎臟組織iNOS和NT表達情況

iNOS、NT陽性反應(yīng)物位于胞質(zhì)中，呈棕黃色。糖尿病模型組iNOS表達水平(0.47±0.08)較正常對照組(0.23±0.02)明顯增多(P＜0.01);PDTC治療組iNOS表達水平(0.31±0.05)較糖尿病模型組明顯減低(P＜0.05)，見圖3。糖尿病模型組NT表達(0.39 ±0.04)較正常對照組(0.22 ±0.01)明顯增多(P ＜0.01);PDTC 治療組 NT表達(0.29±0.03)較糖尿病模型組明顯減低(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Immunohistochemical staining of iNOS and NT in rat kidneys(×400).圖3 免疫組化檢測大鼠腎臟組織中iNOS和NT表達

討 論

DN作為糖尿病的慢性并發(fā)癥，其發(fā)病率隨著糖尿病的快速增長而逐年上升，已成為終末期腎病的主要原因。在歐洲發(fā)達國家20%～40%的糖尿病患者最終發(fā)展為 DN，成為透析治療患者的首要原因［3］，其治療花費巨大。糖尿病腎病的一個早期指標是尿白蛋白排泄增加，尿微量白蛋白/肌酐是診斷早期糖尿病腎病的一項敏感指標。在本研究中DM組大鼠尿微量白蛋白/肌酐比值明顯增高，經(jīng)PDTC治療后尿微量白蛋白/肌酐明顯減低。DN的主要病理改變是腎小球病變，早期表現(xiàn)為基底膜增厚和系膜基質(zhì)增多，晚期則表現(xiàn)為硬化性改變，不伴明顯細胞增生。目前對其發(fā)病機制尚不清楚。最近大量研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。具有里程碑意義的糖尿病控制和并發(fā)癥試驗(Diabetes Control and Complications Trial，DCCT)和其后續(xù)的糖尿病干預(yù)和并發(fā)癥流行病學(xué)(Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications，EDIC)研究也發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［5］。

機體進行有氧代謝時，不斷地通過非酶促反應(yīng)和酶促反應(yīng)產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，并被胞內(nèi)、胞外的抗氧化系統(tǒng)有效清除。糖尿病高血糖狀態(tài)下，以腎組織中糖代謝紊亂為主的多種因素綜合造成腎組織中化學(xué)性質(zhì)活潑的ROS產(chǎn)生過多，破壞腎組織正常的清除能力，過多不穩(wěn)定的ROS將與脂質(zhì)、蛋白、DNA等分子相互作用導(dǎo)致腎組織學(xué)改變和功能異常，造成氧化應(yīng)激。因此測定體內(nèi)氧化和抗氧化酶的水平可間接反應(yīng)腎臟的損傷程度。SOD是超氧陰離子自由基的清除劑，可抑制自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。GSH－Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽等對過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。機體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，如MDA、酮基、羥基或新的氧自由基等。MDA是過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物，其含量?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。因而測定MDA的量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細胞損傷程度［4］。本實驗結(jié)果顯示:DM組大鼠腎皮質(zhì)中SOD和GSH－PX活性均較NC組明顯降低，而MDA含量較NC組明顯升高;經(jīng)PDTC治療后，SOD和GSH－PX活性明顯增加，而MDA含量明顯降低。表明在糖尿病大鼠腎臟組織中，氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，抗氧化酶的活性下降，引起系膜細胞損傷。PDTC治療后，抗氧化酶活性升高，脂質(zhì)過氧化程度降低，證明PDTC可通過抗氧化來減輕氧化應(yīng)激對腎臟的損傷。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下可激活一系列信號通路如NF－ κB［6－7］。NF － κB 被活化后上調(diào)其下游 iNOS 基因的表達，使NO生成明顯增多。NO是一種信息傳遞分子，容易彌散，半衰期很短，在組織中直接測定非常困難。Kolodziejska等［8］的研究表明，直接檢測組織中iNOS可客觀反映組織中NO的含量。過量的NO可與超氧陰離子迅速結(jié)合生成氧化作用更強的過氧亞硝基陰離子(ONOOˉ)，過量產(chǎn)生的ONOOˉ可通過多種機制修飾多種生物分子，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失，最終導(dǎo)致糖尿病多種并發(fā)癥的發(fā)生。糖尿病腎病患者腎活檢組織和糖尿病動物腎臟組織中ONOOˉ的形成和氧化應(yīng)激增加［9］。而NT是ONOOˉ在體內(nèi)生成的特異性標志物，通過檢測NT的生成可反映ONOOˉ的產(chǎn)生［10］。

我們課題組和他人的研究已證實，PDTC可降低糖尿病大鼠的血糖水平［11－12］。本研究經(jīng) HE及Masson染色發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型組腎小球肥大，基底膜增厚，系膜間質(zhì)增多。電鏡顯示糖尿病模型組基底膜明顯增厚，足細胞腫脹，足突融合。免疫組化染色顯示糖尿病模型組iNOS和NT表達明顯增多，進一步證實糖尿病腎病早期損害與iNOS和NT表達增多有關(guān)。經(jīng)PDTC治療后腎臟病理改變明顯減輕，iNOS和NT表達明顯減少。本實驗結(jié)果提示，PDTC一方面可通過降低血糖控制高糖毒性，另一方面，因PDTC是NF－κB阻斷劑，其可能通過阻斷NF－κB信號通路，減少iNOS和NT表達，降低氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激對腎臟的損害，從而達到對糖尿病腎臟的保護作用。本研究結(jié)果為PDTC防治糖尿病腎病提供了實驗依據(jù)。

［1］Jenkins AJ，Best JD，Klein RL，et al.Lipoproteins，glycoxidation and diabetic angiopathy［J］.Diabetes Metab Res Rev，2004，20(5):349－368.

［2］Reed MJ，Meszaros K，Entes LJ，et al.A new rat model of type 2 diabetes:the fat－fed，streptozotocin－treated rat［J］.Metabolism，2000，49(11):1390 －1394.

［3］Dronavalli S，Duka I，Bakris GL.The pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.J Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2008，4(8):444－452.

［4］Ha H，Yu MR，Choi YJ，et al.Role of high glucose－induced nuclear factor－κB activation in monocyte chemoattractant protein－1 expression by mesangial cells［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13(4):894 －902.

［5］Writing Team for the Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications and Research Group.Effect of intensive therapy on the microvascular complications of type 1 diabetes mellitus［J］.JAMA，2002，287(19):2563－2569.

［6］Kaneto H，Matsuoka TA，Katakami N，et a1.Oxidative stress and the JNK pathway are involved in the development of type l and type 2 diabetes［J］.Curr Mol Med，2007，7(7):674－686.

［7］Obrosova IG.Increased sorbitol pathway activity generates oxidative stress in tissue sites for diabetic complications［J］.Antioxid Redox Signal，2005，7(11 －12):1543 －1552.

［8］Kolodziejska KE，Burns AR，Moore RH，et al.Regulation of inducible nitric oxide synthase by aggresome formation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(13):4854－4859.

［9］Ali TK，Matragoon S，Pillai BA，et al.Peroxynitrite mediates retinal neurodegeneration by inhibiting nerve growth factor survival signaling in experimental and human diabetes［J］.Diabetes，2008，57(4):889 － 898.

［10］Peluffo G，Radi R.Biochemistry of protein tyrosine nitration in cardiovascular pathology［J］.Cardiovasc Res，2007，75(2):291－302.

［11］張利眾，趙瑞景，劉建坤，等.吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對2型糖尿病大鼠肝糖原合成的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(12):2442 －2446.

［12］Obrosova IG，Julius UA.Role for poly(ADP－ribose)polymerase activation in diabetic nephropathy，neuropathy and retinopathy［J］.Curr Vasc Pharmacol，2005，3(3):267－283.