榮書玲，王庸晉△，王曉林，趙俊青，賀小峰，胡耀東，劉麗云

(長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院1心內(nèi)科，2兒科，3康復(fù)科，4信息科，山西 長治 046000)

細胞移植是近年來治療心力衰竭的一個全新策略。成肌細胞作為骨骼肌的前體細胞具有以下優(yōu)勢而作為細胞移植的候選細胞之一:自體來源，取材方便，易于在體外擴增，只向肌纖維細胞分化，對缺血耐受力大，植入自體不引起排斥反應(yīng)［1］。但細胞移植由于移植細胞的生存率低而影響了治療效果。胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1，IGF－1)是人體內(nèi)的一種重要的細胞因子。它具有廣泛的生物學(xué)活性［2］，它可以促進細胞的增殖、分化，還可以抑制細胞的凋亡，促進局部血管化，增強機體免疫功能等生物活性［2－3］。因此，IGF－1成為基因治療某些疾病的理想靶點。如果用IGF－1基因修飾的成肌細胞移植改善受損的心功能，一方面，骨骼肌成肌細胞能替代壞死的心肌細胞發(fā)揮收縮功能，另一方面，IGF－1基因修飾的成肌細胞分泌的IGF－1可以改善病損部位的微環(huán)境，通過多種途徑抑制移植細胞的凋亡，從而進一步改善受損的心功能。因此，本研究首先探討了IGF－1基因修飾的骨骼肌成肌細胞對成肌細胞缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響，為下一步將IGF－1基因修飾的成肌細胞移植到受損心肌改善心功能奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動物

新生SD大鼠的乳鼠(1～3 d)由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號為SCXK(鄂)2004－0007，實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定［4］。

2 主要試劑

DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco;Desmin抗體購自Sigma，轉(zhuǎn)染試劑Poly－brene購自Sigma;pLghIGF－1SN和pLgGFPSN質(zhì)粒由華中科技大學(xué)盧永昕教授惠贈，PT67包裝細胞購自Clontech，E86包裝細胞購自ATCC，F(xiàn)ugene6轉(zhuǎn)染試劑購自Roche，兔抗人IGF－1單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，人IGF－1 ELISA檢測試劑盒購自 R＆D，Trizol RNA提取試劑盒購自 Gibco－BRL，原位細胞凋亡檢測盒購自Roche，RT－PCR試劑盒購自Invitrogen，其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 成肌細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和轉(zhuǎn)染 鼠骨骼肌成肌細胞的分離和培養(yǎng)按照以前描述的方法［5］。培養(yǎng)瓶的底部放人無菌的蓋玻片，成肌細胞生長3～4 d后，取出蓋玻片，PBS洗2次，冷丙酮固定，按常規(guī)SP染色方法進行Desmin免疫組化染色的檢測。

3.2 基因轉(zhuǎn)染成肌細胞 PT67包裝細胞用含100 mL/L胎牛血清DMEM培養(yǎng)，E86包裝細胞用含100 mL/L小牛血清DMEM培養(yǎng)。分別將攜帶人胰島素樣生長因子1(human insulin－like growth factor 1，hIGF－1)基因的pLghIGF－1SN質(zhì)粒和攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的對照質(zhì)粒pLgGFPSN，用二步轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染E86和PT67包裝細胞，G418篩選并擴增陽性細胞克隆。收集病毒液用0.45 μm的濾器過濾后凍存于－80℃的冰箱。

將純化的成肌細胞傳代到不同的培養(yǎng)瓶中，待細胞長滿到約70%時，吸去培養(yǎng)液，分別取含pLgGFPSN和pLghIGF－1SN的病毒上清及polybrene的混合液，培養(yǎng)過夜，第2 d吸去病毒液，換用成肌細胞的正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后在共聚焦顯微鏡下觀察其綠色熒光的強度，換用含G418的培養(yǎng)基篩選并擴增陽性克隆。

3.3 基因在成肌細胞的表達

3.3.1 免疫細胞化學(xué)鑒定基因在成肌細胞的表達人IGF－1蛋白在成肌細胞中的表達采用免疫組織化學(xué)方法。所用Ⅰ抗為兔抗人IGF－1單克隆抗體(1∶100)，Ⅱ抗為生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，Ⅲ抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵白素，DAB顯色液顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1936年2月，紅二、六軍團幫助大定八堡建立苗族獨立團。據(jù)統(tǒng)計，“紅軍幫助黔西北各族人民共建立了95個游擊團，”[17]在貓山、松桃建立了苗民游擊隊。紅軍在貴州活動中，還幫助各族人民建立蘇維埃政權(quán)。黔西北成立建川滇黔省革命委員會。在各級蘇維埃政權(quán)中，選拔培養(yǎng)了一批少數(shù)民族干部，“松桃甘龍區(qū)10個鄉(xiāng)蘇維埃有34位苗族干部，占干部總數(shù)的40%，”[18]P81-86嚴(yán)家坡革命委員會正副主席都是苗族。也正是因為在紅軍幫助下建立了不少少數(shù)民族武裝，從而在貴州幾乎形成了遍及省內(nèi)各地聲勢浩大的武裝斗爭怒潮。

3.3.2 RT－PCR檢測成肌細胞中 hIGF－1 mRNA表達 成肌細胞分3組，IGF組(轉(zhuǎn)入hIGF－1基因的細胞)，GFP組(轉(zhuǎn)入GFP基因的細胞)，control組(未轉(zhuǎn)染的成肌細胞)?；蜣D(zhuǎn)染成肌細胞后72 h，用Trizol RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，紫外光檢測樣品吸光度，A260/A280為1.8～2.0。應(yīng)用 RTPCR法(按照RT－PCR試劑盒說明操作)檢測成肌細胞中hIGF－1 mRNA的表達。引物設(shè)計，hIGF－1上游引物5’－ATGCACACCATGTCCTCCTCGCAT－3’，下游引物 5’－CTACATCCTGTAGTTCTTGTT－3’;GAPDH 上游引物 5’－TTCTTGTGCAGTGCCAGCCTCGTC－3’，下游引物5’－TAGGAACACGGAAGGCCATGCCAG－3’。以GAPDH作為內(nèi)參照進行標(biāo)化。

3.4 ELISA法檢測hIGF－1表達 成肌細胞培養(yǎng)上清中hIGF－1濃度采用雙抗體一步夾心ELISA法檢測。實驗步驟按照試劑盒的操作說明進行。從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL;待測樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL;隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的hIGF－1抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機洗板)。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值。計算樣品濃度。

3.5 IGF－1基因修飾成肌細胞對成肌細胞增殖的影響 取3組生長良好，數(shù)目為2×106的成肌細胞，其中一組轉(zhuǎn)入IGF－1基因(IGF組)，另一組轉(zhuǎn)入GFP基因(GFP組)，未轉(zhuǎn)染的成肌細胞作為細胞對照(control組)，在轉(zhuǎn)染3～14 d用細胞計數(shù)儀分別計數(shù)3組細胞的數(shù)目，比較3個不同組中成肌細胞的增殖情況，觀察IGF－1基因轉(zhuǎn)染對成肌細胞增殖的影響。

3.6 IGF－1基因轉(zhuǎn)染對成肌細胞缺血再灌注損傷的影響 基因轉(zhuǎn)染成肌細胞后7 d，IGF－1組和GFP組的成肌細胞用PBS洗滌2～3次，然后加入模擬的缺血液，在模擬缺血條件下(5%CO2、1%O2、94%N2、37℃培養(yǎng)箱中缺氧、缺糖)培養(yǎng)1 h，之后將模擬缺血液吸盡并加入正常DMEM(含胎牛血清)培養(yǎng)基，放至普通培養(yǎng)箱中(5%CO2、37℃)繼續(xù)培養(yǎng)6 h。實驗結(jié)束后，取出細胞爬片，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，用TUNEL法檢測成肌細胞凋亡，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行，control組細胞作為正常對照。細胞顯色后，在光鏡下觀察凋亡陽性細胞。計數(shù)5個200倍視野，以平均每100個細胞核中含凋亡細胞個數(shù)作為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

3.7 RT－PCR檢測IGF－1基因轉(zhuǎn)染對bax和bcl－2 mRNA表達的影響 缺血再灌注損傷后6 h，用Trizol RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，紫外光檢測樣品吸光度，A260/A280為1.8～2.0。應(yīng)用RT －PCR 法(按照RT－PCR試劑盒說明操作)檢測成肌細胞中bax和bcl－2 mRNA的表達，以GAPDH作為內(nèi)參照進行標(biāo)化。bax上游引物5’－GCAGAGGATGATTGCTGATG－3’，下游引物 5’－CTCAGCCCATCTTCTTCCAG － 3’;bcl－2:上游引物 5’－TCCATTATAAGCTGTCACAG－3’，下 游 引 物 5’ －GAAGAGTTCCTCCACCAC－3';GAPDH上游引物5’－TTCTTGTGCAGTGCCAGCCTCGTC－3’，下游引物5’－TAGGAACACGGAAGGCCATGCCAG －3’。

3.8 Western blotting檢測 IGF－1基因轉(zhuǎn)染對caspase－3活化的影響 缺血再灌注損傷后6 h，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解3組成肌細胞，15000 r/min離心30 min，吸取上清(可溶性蛋白)，并以BCA法定量總蛋白。然后進行SDS－PAGE電泳，蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉2h，加入活化的caspase－3單抗4℃過夜，TBS－T(含0.05%Tween 20的TBS)洗滌，HRP－標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBS－T洗滌后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法顯色，之后曝光顯影。采用Bio－Rad公司Quantity One分析軟件對顯影條帶進行灰度分析，將目的蛋白與GAPDH灰度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 成肌細胞免疫細胞化學(xué)鑒定

我們用攜帶hIGF－1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染成肌細胞，G418篩選后免疫細胞化學(xué)檢測可見hIGF－1在成肌細胞中的表達，見圖1B。

Figure 1.Expression of desmin(A)and hIGF－1(B)in rat myoblasts detected by immunocytochemistry(×200).圖1 免疫細胞化學(xué)鑒定desmin和hIGF－1在大鼠成肌細胞的表達

2 RT－PCR檢測成肌細胞中hIGF－1 mRNA表達

成肌細胞感染后72 h，RT－PCR檢測顯示，hIGF－1基因轉(zhuǎn)染的細胞(IGF組)中有 hIGF－1 mRNA的表達，而GFP基因轉(zhuǎn)染的成肌細胞(GFP組)及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的成肌細胞(control組)未見hIGF－1 mRNA的表達，見圖2。

Figure 2.Expression of hIGF － 1 mRNA in myoblasts.IGF:myoblasts transfected with pLghIGF－1SN;GFP:myoblasts transfected with pLgGFPSN;control:untransfected myoblasts..n=6.*P＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs GFP.圖2 成肌細胞中hIGF－1 mRNA的表達

3 ELISA法檢測hIGF－1表達

ELISA法檢測結(jié)果顯示，IGF組細胞上清中有hIGF－1蛋白的表達。而GFP組細胞及control組細胞上清中未檢測到hIGF－1蛋白的表達，見圖3，hIGF－1的有效表達在成肌細胞至少可持續(xù)4周以上。

Figure 3.Expression of hIGF－1 in conditioned medium detected by ELISA..n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs GFP.圖3 ELISA法檢測各組細胞分泌的hIGF－1濃度

4 IGF－1基因轉(zhuǎn)染促進成肌細胞的增殖

3個不同組最初培養(yǎng)的細胞數(shù)為2×106，基因轉(zhuǎn)染后3 d，IGF組和GFP組細胞數(shù)顯著低于未轉(zhuǎn)染的細胞［IGF組:(1.21±0.04)× 106，GFP組:(1.23±0.03)×106cells，control組:(2.87 ±0.13) ×106］，然而到轉(zhuǎn)染后14 d，IGF組的細胞數(shù)顯著高于GFP組的細胞和未轉(zhuǎn)染的細胞［IGF組:(11.36±0.01)×106，GFP 組:(8.09 ±0.02)×106，control組:(10.58±0.02)×106］，IGF 組增加的細胞數(shù)顯著高于GFP組和control組(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The numbers of increased myoblasts in different groups..n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs GFP.圖4 基因轉(zhuǎn)染成肌細胞后增加的細胞數(shù)

5 IGF－1基因轉(zhuǎn)染成肌細胞對成肌細胞缺血再灌注損傷的影響

成肌細胞缺血再灌注損傷6 h后細胞凋亡檢測結(jié)果顯示:缺血/再灌注損傷后IGF－1基因轉(zhuǎn)染的成肌細胞的凋亡百分率顯著低于GFP基因轉(zhuǎn)染的成肌細胞。IGF－1基因轉(zhuǎn)染顯著抑制了成肌細胞的凋亡(P＜ 0.05)，見圖5。

6 RT－PCR檢測IGF－1基因轉(zhuǎn)染成肌細胞對成肌細胞bax和bcl－2 mRNA表達的影響

成肌細胞缺血再灌注損傷6 h后，RT－PCR檢測結(jié)果顯示，IGF組成肌細胞的bax mRNA表達顯著低于GFP組的成肌細胞，bcl－2 mRNA表達顯著高于GFP組成肌細胞(P＜0.05)，見圖6。IGF－1基因轉(zhuǎn)染顯著增加了抗凋亡基因的表達，抑制了促凋亡基因的表達。

7 Western blotting檢測 IGF－1基因轉(zhuǎn)染對caspase－3表達的影響

Western blotting結(jié)果顯示，IGF組細胞與GFP組細胞相比，活化的caspase－3蛋白表達顯著降低(P ＜ 0.05)，見圖7。

討 論

基因修飾的細胞移植為受損心肌的修復(fù)提供了有效方法，但是，細胞移植存在的最大問題是移植細胞的生存問題。大部分被移植細胞在移植早期由于損傷心肌的缺血及炎性氧化應(yīng)激環(huán)境而發(fā)生死亡。細胞的死亡直接影響著心功能的恢復(fù)。研究證實通過聯(lián)合基因治療可以改善移植細胞的生存，從而改善心臟功能［6－8］。因此，尋找一個理想的候選細胞和一個有效的抗凋亡基因是目前細胞移植的一個關(guān)鍵問題。

Figure 5.Apoptotic cells in different groups detected by TUNEL(×200)..n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs GFP.圖5 hIGF－1基因轉(zhuǎn)染成肌細胞對成肌細胞缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響

Figure 6.Expression of bcl－2(A)and bax(B)mRNA after ischemia/reperfusion injury detected by RT－PCR..n=6.*P＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs GFP.圖6 RT－PCR檢測各組細胞缺血再灌注損傷后bax和bcl－2的表達

Figure 7.Expression of cleaved caspase－3 after ischemia/reperfusion injury detected by Western blotting..n=6.*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs GFP.圖7 Western blotting檢測各組細胞缺血再灌注損傷后活化的caspase－3蛋白的表達

近年來，人們嘗試用多種干細胞移植到受損心肌，來改善受損的心功能。目前用于試驗研究的移植細胞有多種，最常用的細胞有胚胎心肌細胞、胚胎干細胞、自體骨髓干細胞、骨骼肌成肌細胞(肌衛(wèi)星細胞)、內(nèi)皮干細胞［9］。各種細胞均有自己的優(yōu)點和不足:胚胎心肌細胞與心肌細胞成分最相近，是最好的選擇，但存在著供體細胞缺少、移植后的排斥反應(yīng)以及倫理沖突等問題。胚胎干細胞為多能干細胞，在體外培養(yǎng)可以分化出心肌細胞，但也存在著來源受限、移植后的排異反應(yīng)，以及倫理學(xué)的問題。而自體骨髓干細胞、骨骼肌成肌細胞、內(nèi)皮干細胞移植則沒有論理學(xué)的制約，也不存在排異問題，不需要終身免疫抑制治療，因此得到了廣泛的研究［10－12］。

骨骼肌成肌細胞是骨骼肌的前體細胞，成肌細胞因其獨特的生物學(xué)特性使其成為基因治療［13］和細胞移植的理想載體［14］。來源于骨骼肌的成肌細胞具有:(1)來源豐富，取材方便(只需局部麻醉)，植入自體不引起排斥反應(yīng);(2)體外容易擴增培養(yǎng):與造血干細胞不同，成肌細胞分離、培養(yǎng)簡單，體外擴增效率較高的;(3)易于外源基因?qū)?成肌細胞是貼壁生長細胞，在體外容易轉(zhuǎn)入外源基因，并表達高水平目的基因產(chǎn)物，并可以分泌重組蛋白;(4)成肌細胞具有較強的抗缺血能力，并可以在宿主體內(nèi)長期存活，有利于目的蛋白穩(wěn)定、持續(xù)地表達;(5)成肌細胞移植后不影響鄰近組織的生理功能，而且肌肉組織易于重復(fù)活檢，應(yīng)用安全;(6)容易通過注射傳遞，為大規(guī)模細胞移植提供了條件;(7)在體內(nèi)不會無限制增殖，沒有致瘤作用。基于以上這些條件，基因修飾的成肌細胞注入到動物體內(nèi)，可作為生物細胞工程治療的載體細胞，來治療某些基因丟失或缺陷疾病，如肌營養(yǎng)不良癥，內(nèi)分泌缺陷，凝血功能障礙(如血友病)等癥。植入后容易與宿主的肌纖維融和，己成為成體干細胞的一個研究熱點和最具價值的組織工程細胞，具有廣泛的應(yīng)用前景［14－16］。

IGF－1是由肝臟合成和分泌的胰島素家族的一種多肽。由于其廣泛的生物學(xué)活性而被廣泛地應(yīng)用于臨床。它在細胞的分化、增殖、個體的生長發(fā)育中具有重要的促進作用。作為刺激因子，可以促進細胞的有絲分裂。抑制細胞的凋亡，增強機體免疫功能等生物活性。因此，IGF－1成為基因治療某些疾病的理想靶點［2－3］。將hIGF－1基因?qū)牍趋兰〕杉〖毎?，治療缺血性疾?如心肌缺血損傷)以及促進創(chuàng)傷修復(fù)將具有更好的效果。為此，我們首先探討了hIGF－1本身對骨骼肌成肌細胞的增殖與凋亡是否有影響。

目的基因的轉(zhuǎn)染有穩(wěn)定和瞬時轉(zhuǎn)染兩種。瞬時轉(zhuǎn)染中，目的基因序列不整合到宿主基因組中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以整合到宿主的染色體中，因此可以實現(xiàn)目的基因在宿主體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地表達［17－18］。

因此，本實驗以大鼠成肌細胞作為候選細胞，IGF－1基因作為理想的靶基因，將攜帶hIGF－1的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的成肌細胞，并從mRNA水平、蛋白水平及細胞水平均可檢測到IGF－1基因在靶細胞內(nèi)的存在，而對照組未見hIGF－1的表達，證明IGF－1基因成功轉(zhuǎn)染到成肌細胞中并在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平得以表達。一個基因的最終表達結(jié)果是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)，因此檢測蛋白質(zhì)是測定基因表達的主要標(biāo)志。實驗利用免疫細胞化學(xué)方法檢測hIGF－1基因轉(zhuǎn)染成肌細胞，并用G418篩選后，可見轉(zhuǎn)染細胞幾乎全部表達，說明轉(zhuǎn)染hIGF－1基因的成肌細胞可穩(wěn)定、高效地表達hIGF－1。

本研究用重組hIGF－1轉(zhuǎn)染骨骼肌成肌細胞，然后觀察了hIGF－1對成肌細胞增殖及缺血再灌注損傷后凋亡的影響。結(jié)果顯示，IGF－I基因轉(zhuǎn)染成肌細胞后，攜帶hIGF－1基因的成肌細胞可以持續(xù)穩(wěn)定表達hIGF－1，在體外顯著促進了成肌細胞的增殖，并可對抗缺血缺氧誘導(dǎo)的細胞凋亡。由于在細胞移植治療中需要大量的細胞，這為成肌細胞在IGF－I誘導(dǎo)下的擴增及將來臨床大規(guī)模的細胞移植提供了有利的條件。

Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，細胞凋亡的最終途徑為激活caspase－3蛋白酶，caspase－3通常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的caspase－3裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡。另外，在凋亡過程中，Bcl－2和Bax也起著非常重要的作用，Bcl－2是抑制凋亡的主要蛋白，Bax是促進凋亡的主要蛋白［19］。因此，在進一步的研究中，我們通過檢測hIGF－1基因轉(zhuǎn)染對成肌細胞caspase－3表達的影響，對bcl－2和bax mRNA表達的影響，探討了hIGF－1抑制成肌細胞凋亡的機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hIGF－1轉(zhuǎn)染成肌細胞顯著地降低了caspase－3和bax的表達，增加了bcl－2的表達，這一結(jié)果提示我們，IGF－1介導(dǎo)的抗凋亡效果可能與降低細胞的Bax和caspase－3表達，增加Bcl－2表達有關(guān)。

綜上所述，IGF－1基因修飾的成肌細胞分泌的IGF－1蛋白在體外促進了成肌細胞的增殖，減少了缺血再灌注損傷的成肌細胞的凋亡，這些結(jié)果為進一步的動物實驗及臨床研究提供了實驗依據(jù)。

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