李旺林,曹 杰,肖煥擎,張偉健,楊 平,鐘俊斌,張 通
(廣州醫(yī)學(xué)院附屬廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科,廣東 廣州 510180)
炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一類腸道慢性、反復(fù)發(fā)作性非特異性炎癥性疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD)。IBD在我國的發(fā)病率逐年升高。腸道菌群是結(jié)腸炎癥發(fā)病的必要條件[1],但關(guān)于腸道正常菌群在結(jié)腸炎癥恢復(fù)中的作用并未得到充分重視,目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本課題擬對此進(jìn)行探索,以明確腸道大腸埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)在結(jié)腸炎癥恢復(fù)中的作用。
葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)分子量5 kD,購自Sigma,用生理鹽水配制成3.5%濃度[2]。抗生素混合物:卡那霉素(8 g/L)、慶大霉素(0.7 g/L)、多黏菌素(3.4 ×107U/L)、甲硝唑(4.3 g/L)和萬古霉素(0.9 g/L)加入飲用水中。
2.1 細(xì)菌耗竭小鼠(bacteria-depleted mice,BD小鼠)的制作 6周大成年小鼠,通過添加混合抗生素(每天每只鼠用100 μL混合抗生素)來耗盡腸腔內(nèi)細(xì)菌,加入飲用水2周,制作BD小鼠。使用抗生素后,收集小鼠新鮮糞便樣本,每天在3種不同培養(yǎng)基、有氧和無氧條件下進(jìn)行細(xì)菌檢測。培養(yǎng)基中不能檢測出細(xì)菌為BD小鼠制作成功。
2.2 動(dòng)物及分組 BALB/c小鼠,SPF級,雌性,8周齡,體重(19.2 ±2.0)g,分籠飼養(yǎng),平均每籠6 只。溫度20~22 ℃,相對濕度55%±5%。建立12 h明暗周期。隨機(jī)分成4組:(1)生理鹽水組,不用DSS水喂養(yǎng),一直飲用正常飲用水;(2)單純DSS組,正常BALB/c小鼠DSS 5 d造模+正常飲用水14 d;(3)BD小鼠+DSS組(無E.coli處理組),BD小鼠5 d造模+正常飲用水14 d;(4)BD小鼠+DSS+E.coli組(E.coli處理組),BD小鼠DSS 5 d造模+正常飲用水(同時(shí)以E.coli喂養(yǎng),每次1×109CFU,每2 d喂養(yǎng)1次)14 d。
2.3 動(dòng)物處理 前5 d自由飲用3.5%DSS溶液造成潰瘍性結(jié)腸炎模型[2],然后繼續(xù)正常飲水14 d。前3組均予以正常飲食飲水;BD小鼠E.coli處理組予以E.coli喂養(yǎng),1×109CFU/次,每2 d喂養(yǎng)1次。每天測量動(dòng)物體重,記錄大便性狀和隱血情況,計(jì)算疾病活動(dòng)度(disease activity index,DAI)評分,具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。同時(shí)記錄小鼠的死亡情況。第14 d,二氧化碳法處死小鼠,游離結(jié)腸和遠(yuǎn)端回腸,取出肛門至盲腸末端的整個(gè)結(jié)腸和直腸段,觀察各組小鼠結(jié)腸的大體改變,測量整個(gè)結(jié)腸長度。用預(yù)冷無菌生理鹽水將結(jié)腸沖洗干凈,分別于結(jié)腸末端(距肛門1 cm)處剪取0.5 cm長的結(jié)腸,4%甲醛浸泡,石蠟包埋、切片,HE染色做病理檢查。
表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1.DAI scoring standard
標(biāo)本固定、石蠟包埋、切片及HE染色后,由病理科醫(yī)生采用盲法對病理切片進(jìn)行評分。結(jié)腸炎的組織學(xué)嚴(yán)重程度依照Cooper等[3]提出的評分標(biāo)準(zhǔn)分為黏膜損害(D)和病變范圍(E)兩方面。具體評分標(biāo)準(zhǔn):黏膜損害(D):0分:無;1分:靠近基膜1/3的隱窩丟失;2分:靠近基膜2/3的隱窩丟失;3分:隱窩全部消失,上皮細(xì)胞完整覆蓋;4分:隱窩、上皮均消失;病變范圍(E):0分:無;1分:局灶性;2分:病變約累及1/3黏膜;3分:病變約累及2/3黏膜;4分:病變累及全部黏膜組織。組織病理學(xué)評分的總分(histological score,HS)等于D與E的乘積,即HS=D×E。
依Krawisz等[4]方法測定組織MPO活性,作為評價(jià)中性粒細(xì)胞浸潤的指標(biāo)之一。取50~100 mg病變結(jié)腸組織,準(zhǔn)確稱量后迅速至液氮中冷卻,-80℃保存。測定時(shí)將組織切碎制成勻漿,離心后取上清液于460 nm處測吸光度(A)值,5 min后再次測定,獲得該樣本的MPO活性,以U/g組織表示。
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的三步法(標(biāo)記的鏈酶親和素-生物素法,即LSAB法)進(jìn)行檢測。Ⅰ抗為NF-κB p65亞基[5]的特異性單克隆抗體:Ⅱ抗為生物素標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體,兩者均為Santa Cruz產(chǎn)品。取400倍視野5個(gè)進(jìn)行評分,取其平均。根據(jù)NF-κB陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分,評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[6]:0分:0% ~1%;1分:2% ~5%;2分:6% ~10%;3分:11% ~25%。
采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。組織學(xué)評分采用非參數(shù)檢驗(yàn),其余數(shù)據(jù)使用單因素方差分析,以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
各組飲用DSS的小鼠體重均有下降,而且在停止飲用DSS后正常BALB/c小鼠體重繼續(xù)稍有降低,無E.coli處理的BD小鼠組體重繼續(xù)出現(xiàn)下降,E.coli處理組體重亦稍有下降。至實(shí)驗(yàn)第18 d,后兩組體重比較有顯著差異(P<0.05),見圖1。
Figure 1.Weight changes of the mice in different groups..n=10,*P <0.05 vs BD+DSS+E.coli group.圖1 各組體重變化
Figure 2.The change of survival rate in each group after DSS treatment.n=10.圖2 DSS處理后各組生存率的變化
觀察至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,生理鹽水組、DSS組和E.coli處理組的存活率均為100%;無E.coli處理組的死亡率為40%。這說明,BD小鼠經(jīng)DSS處理增加了死亡率。而對DSS處理的BD小鼠隨后的E.coli喂養(yǎng)減少了其死亡率,見圖2。
飲用DSS的小鼠從第3 d開始出現(xiàn)大便隱血陽性,DAI評分均見不同程度的增加,停止飲用DSS后DAI評分繼續(xù)緩慢增高,各組在實(shí)驗(yàn)第10 d DAI評分出現(xiàn)一次高峰,而后DSS組和E.coli處理組評分緩慢下降;至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)DSS組DAI評分低至5.3±1.7;E.coli處理組 DAI評分與無 E.coli處理組有顯著差別(P<0.05),見表2。
表2 各組小鼠DAI評分Table 2.DAI scores of the mice in different groups(.n=6)
表2 各組小鼠DAI評分Table 2.DAI scores of the mice in different groups(.n=6)
△P <0.05 vs DSS;*P <0.05 vs BD+DSS.
Group 3 d 6 d 10 d 18 d Normal saline 0 0 0 0 DSS 2.6±1.0 7.6±2.1 7.0±1.8 5.3±1.7 BD+DSS 2.2±0.7 7.4±1.6 8.7±0.4△ 9.8±0.4△BD+DSS+E.coli 2.3±0.4 7.5±0.5 7.0±0.6* 6.4±0.3*
飲用DSS的小鼠結(jié)腸長度較正常小鼠縮短,其中單純DSS組小鼠和E.coli處理組結(jié)腸長度稍長于無E.coli處理的BD小鼠組(P<0.05);將結(jié)腸清洗后測量全結(jié)腸重量,與無E.coli處理組比較,E.coli處理組重量減輕,兩者差異顯著(P<0.05),見表3。
表3 不同處理組的結(jié)腸長度、結(jié)腸重量、組織病理評分、MPO活性和NF-κB評分Table 3.Colon length,colon weight,histological score(HS),MPO activity and NF-κB score in different groups(.n=8)
表3 不同處理組的結(jié)腸長度、結(jié)腸重量、組織病理評分、MPO活性和NF-κB評分Table 3.Colon length,colon weight,histological score(HS),MPO activity and NF-κB score in different groups(.n=8)
△P <0.05 vs DSS;*P <0.05 vs BD+DSS.
Group Colon length(cm)Colon weight(mg) HS MPO(U/g) NF-κB Normal saline 8.8 ±0.6 323.3 ±23.2 0.0 ±0.0 0.2±0.1 0.3 ±0.5 DSS 6.9 ±0.9 450.3 ±25.6 6.3 ±2.4 0.9 ±0.2 2.3 ±0.5 BD+DSS 6.2 ±0.6△ 638.7 ±20.6△ 9.2 ±2.3△ 0.4 ±0.2△ 1.0 ±0.0△BD+DSS+E.coli 6.8 ±0.9* 474.7 ±19.1* 6.8 ±2.1* 0.9 ±0.1* 2.3 ±0.6*
無E.coli處理的BD小鼠在恢復(fù)期結(jié)腸組織學(xué)見炎癥累及黏膜基底層,表現(xiàn)為廣泛的黏膜、腺體缺損,隱窩破壞和大量的炎癥細(xì)胞浸潤。E.coli處理后,小鼠結(jié)腸黏膜缺損部分修復(fù),隱窩破壞減少,炎性細(xì)胞浸潤減輕,炎癥深度約為粘膜全層1/3~2/3;單純DSS組組織損傷稍輕。與無E.coli處理組比較,E.coli處理組組織損傷減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖 3、表 3。
E.coli組腸黏膜MPO活性與無E.coli處理組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。
DSS組和E.coli處理組可見較多NF-κB活化的細(xì)胞,即陽性細(xì)胞?;罨腘F-κB主要見于固有層中,高倍鏡下可見染色主要位于細(xì)胞核,呈棕褐色。相比之下,無E.coli處理組陽性細(xì)胞明顯減少。無E.coli處理組活化的NF-κB評分明顯低于DSS組和E.coli處理組,見圖4、表3。
IBD被認(rèn)為起因于腸道菌群的免疫反應(yīng)失調(diào),但腸道菌群影響IBD的發(fā)展機(jī)制目前仍不清楚[7]。腸腔內(nèi)每克糞便中包含多達(dá)1×1011個(gè)細(xì)菌。腸道微生物與之間的相互溝通和黏膜已被證明可以調(diào)節(jié)腸道基因的表達(dá)。細(xì)菌菌落已被證明在IBD發(fā)展中起著重要作用。在這種疾病的各種小鼠模型中,在無菌條件下不能產(chǎn)生腸道炎癥,而在無菌性小鼠中重新植入小鼠的正常腸道菌群,則可以導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生[8]。腸黏膜中非致病性微生物可以改變免疫反應(yīng)在體外腸上皮屏障功能。E.coli是人和許多動(dòng)物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細(xì)菌[9],周身鞭毛,能運(yùn)動(dòng),無芽孢,主要生活在大腸內(nèi),為大腸內(nèi)的正常菌群。腸道正常E.coli是否參與了實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的恢復(fù),目前尚未見相關(guān)報(bào)道。
Figure 3.HE staining of the mouse colon sections(×40).A:normal saline;B:DSS;C:BD+DSS;D:BD+DSS+E.coli.圖3 小鼠結(jié)腸HE染色
Figure 4.NF - κB detection of the mouse colon sections(×200).A:normal saline;B:DSS;C:BD+DSS;D:BD+DSS+E.coli.圖4 小鼠結(jié)腸NF-κB檢測
通常來說,DSS誘導(dǎo)所造成的小鼠結(jié)腸炎能夠自愈[10]。相反,BD小鼠口服抗生素2周,不能夠從DSS誘導(dǎo)引起的損傷中恢復(fù),表明宿主腸道微生物的相互作用是恢復(fù)的必需的條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,共生的 E.coli能夠降低BD小鼠中DSS誘導(dǎo)小鼠的死亡率,促進(jìn)結(jié)腸炎癥恢復(fù)。外源性E.coli的喂養(yǎng)能夠促進(jìn)結(jié)腸炎癥恢復(fù),降低DSS誘導(dǎo)炎癥小鼠死亡率,強(qiáng)烈提示了腸道E.coli在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥中的恢復(fù)作用,提示正常腸道E.coli的存在是結(jié)腸炎癥恢復(fù)的必要條件,正常腸道E.coli可能能夠治療結(jié)腸炎癥,在結(jié)腸炎癥中調(diào)整腸道菌群有助于腸道炎癥恢復(fù)。
由于腸黏膜炎癥壞死潰瘍形成導(dǎo)致結(jié)腸縮短,這些改變客觀地反映了腸組織的損傷程度。飲用DSS小鼠結(jié)腸長度均較正常小鼠縮短,但喂養(yǎng)結(jié)腸正常腸道E.coli可以阻止結(jié)腸縮短,這可能與E.coli能夠減少腸道炎癥,減少疤痕形成有關(guān)。病理組織學(xué)方面,各組小鼠結(jié)腸大體較呈現(xiàn)腸腔內(nèi)少量積血,鏡下見隱窩和腺體有不同程度的破壞,但炎性細(xì)胞浸潤較為明顯。E.coli治療組可以恢復(fù)腸黏膜完整性,減少腸道出血和炎癥細(xì)胞的浸潤,動(dòng)物組織學(xué)評分比較常規(guī)組均有降低。結(jié)果說明E.coli對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥有促進(jìn)恢復(fù)的作用。
給BD小鼠喂養(yǎng)大腸陰性桿菌能夠提高DSS所致NF-κB的活化指標(biāo),與無E.coli喂養(yǎng)組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,上述研究結(jié)果提示,正常大腸陰性桿菌可以促進(jìn)NF-κB活化,促進(jìn)炎性細(xì)胞趨化,加速炎癥恢復(fù)。腸道中無正常菌群的小鼠NF-κB的活化指標(biāo)較低,而且不能從DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥中自行恢復(fù)。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)來源于腸道菌群,是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分之一,可通過破壞的上皮屏障進(jìn)入循環(huán)并激活NF-κB[11],如前所述,NF-κB是調(diào)控一系列炎癥因子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。由于腸道中無正常菌群,所以腸道中缺少LPS,而LPS缺乏導(dǎo)致了腸道內(nèi)NF-κB不能或者較少激活,從而不能啟動(dòng)腸道的抗炎保護(hù)機(jī)制,使之難以從DSS誘導(dǎo)腸炎中自行恢復(fù)。在我們給小鼠喂養(yǎng)E.coli后,增加了腸道內(nèi)LPS含量,從而使NF-κB能夠正常激活,這一條抗炎途徑能夠啟動(dòng),使小鼠能夠在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中逐漸得到恢復(fù)。提醒我們,腸道正常菌群的存在可能是腸炎恢復(fù)的必要條件。
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