趙秀鶴，曹麗麗，王勝軍，張同霞，劉學(xué)伍，遲兆富

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250012)

細(xì)胞間直接的電緊張性連接，即縫隙連接(gap junction，GJ)，是細(xì)胞間直接交換物質(zhì)和信息的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、多細(xì)胞器官間的協(xié)調(diào)及機(jī)體自我穩(wěn)定控制方面有重要作用［1-2］。近年來的研究表明，由縫隙連接形成的電突觸在腦內(nèi)形成一種交通環(huán)路，控制和維持局部的興奮性活動(dòng)，在癲癇同步化發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，與化學(xué)性突觸可能是其中共同存在的兩種突觸傳遞機(jī)制［1-4］。本文以戊四唑(pentylenetetrazol，PTZ)誘發(fā)的大鼠癲癇模型為對(duì)象，研究縫隙連接蛋白(connexin，Cx)32和Cx43在神經(jīng)元的表達(dá)，并分別加用抗癲癇藥卡馬西平(carbamazepine，CBZ)和GJ解偶聯(lián)劑甘珀酸(carbenoxolone，CBX)進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)癲癇發(fā)作和Cx32/Cx43表達(dá)的影響，試圖探究GJ在癲癇發(fā)病中的作用及其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 成年雄性Wistar大鼠，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 CBX、CBZ和PTZ均為Sigma產(chǎn)品;兔抗鼠Cx32和Cx43多克隆抗體為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品;SYBR RT-PCR Kit(Perfect Real Time)為TaKaRa大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器設(shè)備 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(Light Cycler 2.0)為Roche產(chǎn)品;PCR擴(kuò)增儀(Tgradient48)為Biometra產(chǎn)品;數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)(Flurochem 9900-50)為 Alpha Innotech產(chǎn)品;恒冷切片機(jī)(CM1900)為L(zhǎng)eica產(chǎn)品。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組和模型的建立 成年雄性Wistar大鼠，體重200～250 g，隨機(jī)分為PTZ組、CBX干預(yù)組(PTZ+CBX組)、CBZ干預(yù)組(PTZ+CBZ組)和生理鹽水對(duì)照組(NS組)4組。PTZ組腹腔注射PTZ 50 mg/kg，0.5 h后再半量注射1次，從出現(xiàn)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［5］Ⅲ級(jí)發(fā)作開始計(jì)時(shí)，分別在 2 h、5 h、8 h、10 h和24 h處死動(dòng)物。PTZ+CBX組預(yù)先腹腔注射CBX 300 mg/kg，0.5 h后按上述方法加注PTZ;PTZ+CBZ組預(yù)先腹腔注射CBZ 40 mg/kg，余處理同上;NS組用等量NS代替PTZ注射，余處理同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組動(dòng)物分別為PTZ組26只，PTZ+CBX組28只，PTZ+CBZ組23只和NS組6只。根據(jù)Racine癲癇大鼠分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判斷動(dòng)物發(fā)作分級(jí)［5］:0級(jí)，正常行為狀態(tài);I級(jí)，面肌抽動(dòng);Ⅱ級(jí)，節(jié)律性點(diǎn)頭;Ⅲ級(jí)，單側(cè)前肢陣攣;IV級(jí)，雙前肢陣攣伴站立;V級(jí)，持續(xù)站立，失去平衡、跌倒。

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Cx32和Cx43

2.2.1 組織切片制備 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(300 mg/kg，腹腔注射)過量麻醉，按常規(guī)方法取腦、固定、OCT包埋、快速冰凍、連續(xù)切片，切片厚度為20 μm，裱于鉻釩明膠包被的清潔載玻片上，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 免疫組織化學(xué)染色(S-P法) 按照試劑盒說明書進(jìn)行，I抗為兔抗Cx32或Cx43抗體。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)及方法:以胞漿或胞核染成棕黃色為陽(yáng)性。在高倍顯微鏡下隨機(jī)選取視野，計(jì)數(shù)大鼠皮層和海馬齒狀回、Ammon角(cornu ammonis)CA1區(qū)和CA3區(qū)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，重復(fù)5次，取其均值作為陽(yáng)性百分率。

2.3 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR法分析Cx32和Cx43的表達(dá)

2.3.1 大鼠海馬標(biāo)本的收集 大鼠經(jīng)斷頭取腦，快速分離出雙側(cè)海馬，置于-80℃冰箱內(nèi)保存待用。

2.3.2 引物設(shè)計(jì) Cx32、Cx43和β-actin的PCR擴(kuò)增引物序列由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。Cx32上游引物5'-TGT AAC AGC GTC TGC TAT GAC-3'，下游引物 5'-GCG AGC ATA AAG ACA GTG AA-3'，擴(kuò)增片段為409 bp;Cx43上游引物5'-CTT CAT GCT GGT GGT GTC C-3'，下游引物 5'-TGG CAT TCT GGT TGT CGT C-3'，擴(kuò)增片段為400 bp;β-actin上游引物5'-AAG ATC CTG ACC GAG CGT GG-3'，下游引物 5'-CAG CAC TGT GTT GGC ATA GAG G-3'，擴(kuò)增片段為 327 bp。

2.3.3 總RNA的提取 按照硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法提取總RNA。

2.3.4 逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng) 按照試劑盒使用說明配成 RT 反應(yīng)體系如下:oligo dT(50 μmol/L)0.5 μL，5 × M-MLV buffer 2 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，M-MLV RT(2 ×108U/L)0.25 μL，RNase inhibitor(4 × 107U/L)0.25 μL，RNA 5 μL，RNase-free dH2O 1.5 μL，總體積 10 μL。將以上反應(yīng)體系于 42℃ 15 min、95℃ 2 min進(jìn)行cDNA合成反應(yīng)。

2.3.5 PCR反應(yīng) 以下各組反應(yīng)體系依次放入Light Cycler PCR儀中進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。Cx32/43 反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex Taq 10 μL，Primer 11.2 μL，Primer 22 μL，cDNA 2 μL，dH2O 5.6 μL，總體積20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性95℃ 10 s，55 ℃ 10 s、72 ℃ 16 s，共40個(gè)循環(huán)。65℃ 15 s、95℃ 0.1℃/s、40℃ 30 s進(jìn)行融解曲線分析。βactin 反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex Taq 10 μL，Primer 10.8 μL，Primer 20.8 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6.4 μL，總體積20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性95℃ 10 s，然后60℃ 10 s退火、72℃ 15 s延伸，共40個(gè)循環(huán)。最后65℃ 15 s、95℃ 0.1℃/s、40℃ 15 s進(jìn)行融解曲線分析。

2.3.6 瓊脂糖凝膠電泳 取目的基因以及β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物各15 μL，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)目的基因的完整性。

2.3.7 結(jié)果分析 結(jié)果以目的基因與內(nèi)參照βactin的比值表示。Cx32(或Cx43)/β-actin比值代表待測(cè)樣本的Cx32(或Cx43)相對(duì)表達(dá)。cDNA樣本重復(fù)2～3管。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 動(dòng)物模型行為學(xué)觀察

PTZ組動(dòng)物在注射PTZ后93%在2 min內(nèi)開始發(fā)作，迅速進(jìn)展為IV級(jí)發(fā)作，80%動(dòng)物出現(xiàn)V級(jí)發(fā)作。每次抽搐持續(xù)1～10 min不等，常反復(fù)發(fā)作。90 min后，除個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)短暫發(fā)作外，大部分動(dòng)物停止發(fā)作。NS組大鼠均無癲癇發(fā)作表現(xiàn)。CBX+PTZ組動(dòng)物發(fā)作強(qiáng)度顯著降低，僅個(gè)別動(dòng)物(10%)出現(xiàn)I級(jí)興奮表現(xiàn)，同時(shí)發(fā)作潛伏期明顯延長(zhǎng)(平均9 min，P＜0.05)。CBZ+PTZ組2只大鼠出現(xiàn)I級(jí)發(fā)作，1只出現(xiàn)Ⅱ級(jí)發(fā)作。

2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

PTZ組大鼠皮層和海馬在致癇2 h后Cx32陽(yáng)性細(xì)胞開始增多(P＜0.05)，8 h后增多更為明顯(P＜0.05)，24 h后表達(dá)降至正常水平(P＞0.05)。Cx43陽(yáng)性神經(jīng)元同樣在致癇2 h開始增多(P＜0.05)，8 h時(shí)達(dá)NS組的2倍(P＜0.05)，至發(fā)作24 h后表達(dá)同樣顯著下降。CBX顯著抑制了Cx32和Cx43的表達(dá)(P＜0.05)。CBZ對(duì)皮層和海馬神經(jīng)元的Cx32和Cx43表達(dá)均無明顯影響(P＞0.05)，除24 h時(shí)點(diǎn)外，余各時(shí)點(diǎn)仍顯著高于NS組和CBX+PTZ組(P＜0.05)，見圖1 和表 1、2。

Fi11gure 1.Expression of Cx32 and Cx43 in the brain of rats(×100).圖1 Cx32和Cx43在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)

表1 大鼠皮層和海馬Cx32蛋白的表達(dá)Table 1.Expression of Cx32 protein in the cortex and hippocampus of rats(.n=6)

表1 大鼠皮層和海馬Cx32蛋白的表達(dá)Table 1.Expression of Cx32 protein in the cortex and hippocampus of rats(.n=6)

#P＜0.05 vs NS group;*P＜0.05 vs PTZ group;△P＜0.05 vs CBX+PTZ group.

Cortex Hippocampus 2 h 8 h 24 h 2 h 8 h 24 h PTZ 29.50±4.04# 50.83±3.49# 21.08±4.51 33.50±3.94# 57.83±3.54#Group 27.66±4.55 CBX+PTZ 16.83±2.71* 22.33±3.20#* 18.42±4.49 22.67±3.01* 35.50±2.74#* 24.21±3.82 CBZ+PTZ 27.17±3.87#△ 47.67±3.33#△ 21.62±5.01 32.00±3.58#△ 54.17±3.31#△ 28.04±5.23 NS 18.00±2.76 17.36±2.37 19.31±3.71 25.17±3.31 23.83±2.32 25.67±4.36

表2 大鼠皮層和海馬Cx43蛋白的表達(dá)Table 2.Expression of Cx43 protein in the cortex and hippocampus of rats(.n=6)

表2 大鼠皮層和海馬Cx43蛋白的表達(dá)Table 2.Expression of Cx43 protein in the cortex and hippocampus of rats(.n=6)

#P＜0.05 vs NS group;*P＜0.05 vs PTZ group;△P＜0.05 vs CBX+PTZ group.

Hippocampus 2 h 8 h 24 h 2 h 8 h 24 h PTZ 20.83±2.48# 38.17±2.64# 18.34±1.68 24.67±3.50# 39.50±3.27#Group Cortex 19.18±3.25 CBX+PTZ 15.67±2.34* 26.67±3.88#* 16.46±2.17 21.17±2.79 24.83±3.76#* 18.58±4.07 CBZ+PTZ 22.17±2.93#△ 36.67±3.01#△ 20.45±3.08 25.50±3.44#△ 36.33±3.14#△ 20.16±4.24 NS 16.50±2.74 17.50±3.27 17.91±2.83 20.50±2.73 19.33±3.14 18.93±2.88

3 實(shí)時(shí)定量RT－PCR結(jié)果

致癇2 h海馬Cx32 mRNA與NS組相比即迅速升高(P＜0.05)，一直持續(xù)至8 h仍顯著高于NS組水平(P＜0.05)，10 h后始明顯降低，接近NS組水平(P＞0.05)。加CBX干預(yù)后2～5 h組Cx32 mRNA水平顯著降低，但仍高于NS組(P＜0.05)，而8 h和10 h時(shí)點(diǎn)接近NS組水平(P＞0.05)。CBZ+PTZ組Cx32 mRNA除10 h組外，余均顯著高于CBX+PTZ組和NS組(P＜0.05)，和PTZ組之間無顯著差異(P＞0.05)。PTZ組Cx43 mRNA表達(dá)水平較低，2 h至5 h表達(dá)顯著高于NS組(P＜0.05)，至8 h時(shí)即降低至NS組水平(P＞0.05)。CBX同樣能夠抑制其表達(dá)，各時(shí)點(diǎn)均接近NS組水平(P＞0.05)，在2 h和5 h時(shí)與PTZ組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CBZ干預(yù)對(duì)Cx43 mRNA表達(dá)無明顯抑制作用，見圖 2、3。

討 論

近年研究認(rèn)為，細(xì)胞間的聯(lián)系仍以化學(xué)性突觸為主，但是“非突觸”機(jī)制如GJ、場(chǎng)效應(yīng)和離子的相互作用等在神經(jīng)元的同步化和癲癇的發(fā)病機(jī)制中可能具有重要地位。GJ在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)是一種獨(dú)立于傳統(tǒng)化學(xué)性突觸的“非突觸”細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，驚厥的發(fā)生不但依賴于興奮性化學(xué)突觸傳遞過程增強(qiáng)，而且也可能與神經(jīng)元之間由縫隙連接形成的電突觸數(shù)目增加有關(guān)［1，6-7］。

Figure 2.Expression of Cx32 mRNA in the hippocampus of rats..n=6.#P＜0.05 vs NS group;*P＜0.05 vs PTZ group;△P＜0.05 vs CBX+PTZ group.圖2 大鼠海馬Cx32 mRNA的表達(dá)

Figure 3.Expression of Cx43 mRNA in the hippocampus of rats..n=6.#P＜0.05 vs NS group;*P＜0.05 vs PTZ group;△P＜0.05 vs CBX+PTZ group.圖3 大鼠海馬Cx43 mRNA的表達(dá)

電突觸能夠促進(jìn)離子通訊和雙向電流的特性使之易于在耦聯(lián)細(xì)胞間形成同步化放電。近幾年，許多離體和在體實(shí)驗(yàn)證明，縫隙連接的存在是癲癇發(fā)生和發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制之一，我們?cè)跓o鎂細(xì)胞癲癇模型中研究 GJ的作用［6，8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTZ致癇2 h后大鼠皮層和海馬Cx32 mRNA和蛋白水平即迅速升高。Cx32主要分布在神經(jīng)元上，參與神經(jīng)元的電活動(dòng)、神經(jīng)元的發(fā)育及傳遞第二信使和一些必需代謝產(chǎn)物［9］。癲癇發(fā)作時(shí)機(jī)體為了適應(yīng)這種反復(fù)過度的電活動(dòng)環(huán)境，其早期表現(xiàn)為加強(qiáng)Cx的合成和利用，以便于維持高頻腦電環(huán)境下神經(jīng)元自身的基本功能，因而早期Cx32的表達(dá)有所增強(qiáng)，但隨著癲癇的這種高頻腦電活動(dòng)的持續(xù)發(fā)生，大量興奮性氨基酸的釋放、鈣超載、氧和葡萄糖相對(duì)供應(yīng)不足，腦內(nèi)ATP儲(chǔ)存減少，造成鈉泵功能抑制，進(jìn)一步加重腦損害，致使神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，因而Cx32表達(dá)隨之減少。上述結(jié)果表明，由Cx32組成的神經(jīng)元上GJ蛋白在癲癇的始動(dòng)和發(fā)生上有一定作用。

Cx43是星形膠質(zhì)細(xì)胞間電突觸的主要縫隙連接蛋白［10-11］，本實(shí)驗(yàn)表明神經(jīng)元表達(dá) Cx43遠(yuǎn)低于Cx32，但是其mRNA和蛋白表達(dá)在癲癇樣放電后同樣明顯增多。Nakase等［12］和 Yoon 等［13］認(rèn)為廣泛的縫隙連接使星形膠質(zhì)細(xì)胞成為一個(gè)功能合胞體，星形膠質(zhì)細(xì)胞興奮引發(fā)的Ca2+內(nèi)流信號(hào)會(huì)在這個(gè)功能合胞體中環(huán)行播散開來，稱為鈣波，對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)具有重要意義。因此Cx43很可能與致癇后腦組織結(jié)構(gòu)重塑有密切關(guān)聯(lián)。

GJ阻斷劑CBX能夠直接和Cx分子結(jié)合，引起通道蛋白構(gòu)象的改變，致通道關(guān)閉，不會(huì)影響神經(jīng)元的內(nèi)在特性［14］。本研究顯示CBX不僅能夠抑制癇性發(fā)作，而且Cx32在基因和蛋白水平均顯著受抑。Cx43 mRNA除2 h時(shí)點(diǎn)外，其它時(shí)點(diǎn)的表達(dá)被CBX顯著抑制，在蛋白水平可能由于表達(dá)較低，接近對(duì)照組水平，故加用CBX無明顯作用。進(jìn)一步證實(shí)，神經(jīng)元之間GJ形成的電突觸在癲癇的形成過程中具有重要作用。神經(jīng)元GJ參與癲癇發(fā)病的可能機(jī)制:(1)GJ允許細(xì)胞間直接交換離子，使神經(jīng)元活動(dòng)快速同步化，癲癇敏感性增強(qiáng);(2)GJ是神經(jīng)元電突觸結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在某些病理情況下，可能使電突觸數(shù)目增加和電傳導(dǎo)性增強(qiáng)，導(dǎo)致電突觸偶聯(lián)的神經(jīng)元數(shù)目增加，有利于神經(jīng)元高度同步化放電，從而增加了癲癇產(chǎn)生的可能性;(3)參與第二信使(Ca2+、cAMP、IP3等)和興奮性氨基酸、自由基等代謝產(chǎn)物傳遞;(4)在某些病理?xiàng)l件下，神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞間GJ數(shù)目增多和偶聯(lián)增加，使信息交流加強(qiáng)而引起星形膠質(zhì)細(xì)胞和遠(yuǎn)隔的神經(jīng)元異常興奮［1］。近來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CBX通過抑制活化小膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸的釋放，降低了缺血所致海馬神經(jīng)元死亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［15］。

縫隙連接可能具有獨(dú)立于傳統(tǒng)化學(xué)性突觸的致癇機(jī)制。在無鈣模型的同步化放電機(jī)制中，GJ參與放電持續(xù)時(shí)間和波幅的調(diào)節(jié)，而無需化學(xué)性突觸的存在［16］。而 Todd 等［17］提出，在發(fā)育過程中，電突觸先于化學(xué)性突觸形成，可能作為前體促進(jìn)其發(fā)育。2型代謝性谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)活化后，可以上調(diào)GJ偶聯(lián)的發(fā)育以及Cx36的表達(dá)，抑制γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid，GABA)A 受體有同樣作用［18］，提示化學(xué)性突觸對(duì)電突觸的調(diào)節(jié)作用。Wang等［19］認(rèn)為，GJ可能參與NMDA受體依賴的興奮性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)。本研究也發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的抗癲癇藥物CBZ僅抑制了PTZ致癇大鼠的癇樣發(fā)作，而不影響縫隙連接蛋白Cx32和Cx43的表達(dá)?？梢姡瑢?duì)化學(xué)性突觸和電突觸的關(guān)系仍需進(jìn)一步深入研究。

一直以來，抗癲癇藥物治療均以對(duì)離子通道以及抑制性氨基酸(如GABA)和興奮性氨基酸(如谷氨酸)的調(diào)節(jié)為目標(biāo)，迄今為止，沒有任何抗癲癇藥物以GJ為治療靶點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)中所用的GJ阻斷劑對(duì)不同的縫隙連接蛋白沒有選擇性。不同的GJ是否與不同的發(fā)作類型有關(guān)，解決這一問題更需要特異性的阻斷劑?？梢娫趥鹘y(tǒng)的以化學(xué)性突觸、離子通道等為作用靶點(diǎn)的抗癲癇藥物外，開發(fā)作用于縫隙連接通道的治療藥物應(yīng)是一個(gè)有希望的研究方向。

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