周 榮，楊彩紅，孫 焱，徐紅娟，李彥紅，姚 巍，王鳳芝△

(山西醫(yī)科大學1第二醫(yī)院心內(nèi)科，2藥理學教研室，3信息管理系，山西 太原 030001;4山西中醫(yī)學院中醫(yī)系西醫(yī)內(nèi)科學教研室，山西 太原 030024)

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)因其具有向心肌細胞分化的潛能、取材方便和免疫排斥反應少的特點備受研究者青睞［1］。近幾年來各國的研究者已成功進行了BMSCs移植的動物實驗，極大地推動了早期非隨機干細胞移植臨床試驗的進行，但臨床試驗結(jié)果卻大相徑庭。造成這種結(jié)果的原因之一是BMSCs中細胞類型魚目混珠，其中能正在發(fā)揮治療作用的干細胞數(shù)量較少且多變，致使植入細胞存活數(shù)量少，分化率低。因此，探求一種能應用于人體的、無毒的、提高移植細胞存活率，促進移植細胞向心肌細胞分化的方法，一直是干細胞移植治療心臟病的研究熱點。

環(huán)磷酸腺苷(3'，5'-cyclic adenosine monophosphate，cAMP)主要通過cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)這條通路的激活能提高與心肌分化相關(guān)的基因如轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Cx43等的表達［2］。因此我們設(shè)想細胞內(nèi) cAMP水平的升高，有助于干細胞向心肌細胞分化。為此我們選用環(huán)磷酸腺苷葡甲胺(meglumine cycle adenylate phosphate，MCA，一種環(huán)磷酸腺苷類似物)加入BMSCs培養(yǎng)液中，測定到細胞內(nèi)cAMP水平升高，心肌特異性蛋白GATA-4、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)和縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)的表達有所增加，表明MCA有促進BMSCs向心肌細胞分化的作用［3］。因此本研究建立心力衰竭(heart failure，HF)模型，在移植BMSCs的同時給予MCA，研究二者聯(lián)合對心力衰竭大鼠心功能的影響，以及移植細胞在心肌組織的存活和心肌特異性蛋白的表達情況，為BMSCs治療心力衰竭尋找一種新思路和新靶點。

材料和方法

1 材料

健康Wistar遠交群大鼠，6～7周齡雄鼠，體重200～220 g左右，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。MCA購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司;阿霉素購自浙江海門藥業(yè)有限公司;5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)購自 Sigma;大鼠腦利鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)ELISA試劑盒購自上海麥莎生物科技有限公司;小鼠抗大鼠BrdU IgG、兔抗大鼠GATA-4 IgG、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)IgG和Cx43 IgG抗體均購自Santa Cruz。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 BMSCs的分離、擴增培養(yǎng)及標記 將大鼠斷頸處死，用75%乙醇浸泡10 min，無菌取雙側(cè)股、脛骨，暴露骨骼端，接裝有PBS的注射器，反復沖出骨髓至骨體變白。沖出的骨髓吹打成細胞懸液后，以1500 r/min離心10 min后，棄去上清，在沉淀中加入適量DMEM培養(yǎng)液，吹打成細胞懸液并接種于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。72 h首次換液，以后每2～3 d換液1次。待細胞長滿瓶底的80%以上時，用0.25%胰酶消化，按1∶2或1∶3比例傳代，相差顯微鏡逐天觀察細胞形態(tài)。取第4代已純化細胞進行移植前標記細胞:在移植前的2 d，將細胞接種到25 mm培養(yǎng)皿，達到60%融合時，加入BrdU使其終濃度為10 μmol/L，孵育48 h，棄去培養(yǎng)液。消化、離心收集細胞，冰上保存?zhèn)湟浦灿谩?/p>

2.2 阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠模型的建立 參照Siveski-Iliskovic等［4］和本課題組摸索的方法建立模型。阿霉素使用劑量按每次2.5 mg/kg，腹腔注射，每周3次，用1周，間隔2周，再用1周，共計6次，總劑量達15 mg/kg。末次注射完成后，觀察4周。

2.3 實驗分組 (1)正常組:正常健康大鼠，無任何處理。(2)HF組:模型鼠，尾靜脈注射等量生理鹽水。(3)BMSCs組:尾靜脈注射 BMSCs 100 μL，大約107個細胞。(4)MCA組:尾靜脈注射MCA注射液(6.25 mg·kg-1·d-1)，連續(xù) 5 d。(5)BMSCs+MCA組:尾靜脈注射等量BMSCs 1次，同時注射等量MCA連續(xù)5 d。以上各組給予相應處理后觀察4周，檢測相關(guān)指標。

2.4 超聲心動圖檢查 干預4周后，進行經(jīng)胸高頻超聲心動圖檢查。使用GE Vivid 7彩色超聲顯像儀，經(jīng)胸壁高頻超聲10S探頭，頻率11.4 MHz，圖像深度2.0 cm。20%烏拉坦800 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，在二維超聲引導下，M型超聲測定左室收縮末期 內(nèi) 徑 (left ventricular end-systolic diameter，LVSD)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVDD)、左室收縮末容積(left ventricular end-systolic volume，LVSV)和左室舒張末容積(left ventricular end-diastolic volume，LVDV)，每一測定值均取3個連續(xù)完整心動周期測量，取其平均值。經(jīng)Simpson法換算左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

2.5 多導生理儀測定心功能 干預4周后麻醉大鼠，分離右側(cè)頸總動脈，插導管至左心室。多導生理記錄儀記錄左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室舒張壓(left ventricular diastolic pressure，LVDP)、心率(heart rate，HR)及左室壓力上升及下降最大變化速率(±dp/dtmax)。連續(xù)測取5次數(shù)據(jù)，每次隔3 min，每一數(shù)據(jù)由3次較穩(wěn)定數(shù)據(jù)求平均值作為結(jié)果。

2.6 血清BNP測定 各組在干預前和干預4周后，取清晨空腹尾靜脈血，離心后取血清。參照說明書方法，采用雙抗夾心ELISA法測定血清BNP水平。

2.7 標記細胞的存活數(shù)量 干預4周后取BMSCs組和MCA+BMSCs組，處死動物后立即開胸，取出心臟，PBS液沖洗，甲醛固定，血清封閉。滴加I抗小鼠抗大鼠BrdU(1∶200)，4℃過夜;滴加II抗山羊抗小鼠IgG，37℃孵育20 min，PBS沖洗。采用DAB顯色，顯微鏡下觀察移植細胞的存活及分布。每個樣本切片選取5個高倍視野(×400)計數(shù)陽性細胞數(shù)，取其平均值為陽性細胞數(shù)。

2.8 Western blotting測定心肌特異性蛋白表達 干預4周后，處死動物后立即開胸，取出心臟，PBS液沖洗，準確稱取左心室一定量的心肌組織，按照1 mg組織加入10 μL細胞裂解液比例制備組織勻漿，并以10000 r/min、4℃離心10 min。取組織上清備用。采用Westren blotting方法測定組織樣品心肌特異性蛋白的表達:I抗分別為 cTnI(1∶300稀釋);Cx43(1∶300 稀釋);GATA-4(1∶200 稀釋)。

2.9 Masson染色 干預4周后，取左心室心肌組織，按標準的病理技術(shù)行甲醛固定、石蠟包埋、切片，行Masson染色。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 動物存活情況

40只大鼠進行造模，其中4只無癥狀突然死亡，2只出現(xiàn)大量腹水而死亡，共死亡6只，存活34只。對大鼠造模前后行超聲心動圖測定，結(jié)果為造模后LVDD和LVSD較造模前有顯著差異 ［(6.52±0.76)mm vs(4.18±0.21)mm，(3.81±0.76)mm vs(1.10±0.15)mm，P ＜0.05］，造模前LVEF和LVFS與造模后相比有顯著差異［(75.34±8.45)%vs(94.51±2.61)%，(41.28±1.93)%vs(73.68±1.87)%，P＜0.05］。以LVEF和LVFS較正常參考值下降20%～30%作為心衰模型建立的標準，有5只大鼠的心室腔無明顯擴大，LVEF降低不明顯，故排除。最后達心衰標準的有29只模型鼠，且這29只模型鼠在整個實驗過程中全部存活，見圖1。

Figure 1.M-mode echocardiography.A:normal rats;B:heart failure rats.圖1 造模前和造模成功后大鼠心臟超聲M型圖

2 干預4周后心功能比較

HF組的心臟超聲結(jié)果為典型的心肌病心衰表現(xiàn)，LVSD及LVDD顯著增大，LVFS及LVEF顯著降低，表明左心功能明顯降低。與HF組相比，LVSD、LVDD、LVEF和LVFS在BMSCs組、BMSCs+MCA組和MCA組均有顯著差異(P＜0.05)，說明這3組的左心功能較HF組均有改善。其中BMSCs+MCA組在改善收縮功能方面最佳，與MSC組和MCA組相比均有顯著差異(P＜0.05);BMSCs組與MCA組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 心臟超聲顯示干預4周后心衰大鼠的心功能變化Table 1.Cardiac functions of rats with heart failure analyzed by echocardiography 4 weeks after injection()

表1 心臟超聲顯示干預4周后心衰大鼠的心功能變化Table 1.Cardiac functions of rats with heart failure analyzed by echocardiography 4 weeks after injection()

△P＜0.05 vs normal group;*P＜0.05 vs HF group;#P＜0.05 vs MCA gruop;▲P＜0.05 vs BMSCs group.

Group n LVDD(mm) LVSD(mm) LVEF(%) LVFS(%)Normal 6 4.21±0.11 1.05±0.24 72.12±1.25 42.14±1.64 HF 6 6.95±0.44△ 4.19±0.15△ 47.45±7.34△ 20.19±1.03△BMSCs 8 5.67±0.74* 2.25±0.96*# 57.67±2.54*# 26.25±1.96*#BMSCs+MCA 8 5.34 ±0.84*# 2.12 ±0.09*# 64.34 ±4.34*#▲ 29.12 ±1.09*#▲MCA 7 6.19±0.62 3.34±0.42 56.67±3.22*24.34±1.42

3 干預4周后血流動力學情況

干預4周后血流動力學相關(guān)指標在各組間比較，均 P＜0.05，差異顯著。其中 MCA組、BMSCs組、BMSCs+MCA組與HF組相比，LVSP、±dp/dtmax明顯升高，LVDP明顯降低(P＜0.01)，提示心臟功能有改善。但與正常組相比還有差距(P＜0.05)。其中BMSCs+MCA組±dp/dtmax較其它組明顯好轉(zhuǎn)(P＜0.05);BMSCs組與MCA組相比差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見表2。

表2 干預4周后心衰大鼠的血流動力學變化Table 2.Hemodynamic data of rats with heart failure 4 weeks after injection()

表2 干預4周后心衰大鼠的血流動力學變化Table 2.Hemodynamic data of rats with heart failure 4 weeks after injection()

＊＊P ＜0.01 vs HF group or normal group;#P ＜0.05 vs MCA group or BMSCs group.

Group n LVSP(kPa) LVDP(kPa) +dp/dtmax(kPa/s) -dp/dtmax(kPa/s)Normal 6 20.34±1.07 -0.34±0.24 911.17±77.30724.33±92.87 HF 6 13.69±2.63 0.89±0.38 331.40±55.89 372.02±46.81 BMSCs 8 17.74 ±2.79＊＊ 0.31 ±0.25＊＊ 579.51 ±27.95＊＊ 477.12 ±47.71＊＊BMSCs+MCA 8 18.03 ±3.91＊＊ 0.24 ±0.44＊＊ 638.57 ±36.86＊＊# 645.54 ±44.55＊＊#MCA 7 16.05±3.31＊＊ 0.32 ±0.27＊＊ 551.11 ±12.08＊＊ 526.86±24.68＊＊

4 血清BNP水平變化

干預前各組BNP水平較正常組相比均有明顯升高，均差異顯著。在BMSCs組和MCA組和BMSCs+MCA組，干預后BNP水平與干預前比較明顯下降(P＜0.05);與HF組相比明顯降低(P＜0.05)，與正常組相比仍有顯著差異(P＜0.05)。干預后BMSCs+MCA組BNP水平與BMSCs組和MCA組相比明顯降低(P＜0.05)。干預后BMSCs組BNP水平與MCA組相比無顯著差異(P＞0.05)，見表4。

表3 干預前后各組血清BNP濃度變化Table 3.Serum BNP level 4 weeks after injection(ng/L.)

表3 干預前后各組血清BNP濃度變化Table 3.Serum BNP level 4 weeks after injection(ng/L.)

＊＊P＜0.01 vs HF group;#P ＜0.05 vs pre-injection;▲P ＜0.05 vs BMSCs group or MCA group.

Normal 6 75.02±7.28 72.15±6.58 HF 6 553.14±32.40 597.26±35.76 BMSCs 8 566.88 ±19.51 376.13 ±27.76＊＊#BMSCs+MCA 8 571.63 ±12.67 343.38 ±17.29＊＊#▲MCA 7 563.86 ±22.49 402.71 ±15.77＊＊#

5 BMSCs在心肌組織的存活

干預4周后進行免疫組化染色觀察BMSCs在心肌組織的存活，在2個行BMSCs移植的組皆可見BrdU陽性的細胞存在，多呈散在分布。對各組陽性細胞進行計數(shù)分析:BMSCs+MCA組的陽性細胞數(shù)多于 BMSCs組(P ＜0.05)，見圖2、表4。

Figure 2.Immunohistochemical staining of BrdU-labeled cells 4 weeks after injection(×100).A:BMSCs group;B:BMSCs+MCA group.圖2 干預4周后BrdU陽性細胞的免疫組化染色

表4 BrdU標記的陽性細胞數(shù)Table 4.The numbers of BrdU-labeled positive cells(.n=8)

表4 BrdU標記的陽性細胞數(shù)Table 4.The numbers of BrdU-labeled positive cells(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs BMSCs group.

＊＊BMSCs 13.50±5.15 BMSCs+MCA 29.75±7.67

6 心肌組織特異性蛋白表達情況

干預4周后測定心肌組織特異性蛋白表達可見，BMSCs組、BMSCs+MCA組與HF組、MCA組相比，GATA-4、cTnI和 Cx43蛋白表達量有所增加(P＜0.05);與 BMSCs組相比，BMSCs+MCA組的GATA-4、Cx43和 cTnI的蛋白表達量較多(P＜0.05);BMSCs組GATA-4表達量多于MCA組(P＜0.05)，見圖3、表5。

Figure 3.GATA-4，Cx43 and cTnI protein expression in rats detected by Western blotting.圖3 各組心肌特異性蛋白的表達

表5 各組心肌特異性蛋白的相對表達量Table 5.Expression of GATA-4，Cx43 and cTNI proteins in rats 4 weeks after injection(.n=6)

表5 各組心肌特異性蛋白的相對表達量Table 5.Expression of GATA-4，Cx43 and cTNI proteins in rats 4 weeks after injection(.n=6)

＊＊P＜0.01 vs HF group;#P ＜0.05 vs BMSCs group or MCA group;▲P ＜0.05 vs MCA group.

Group GATA-4 Cx43 cTNI 0.25±0.26 0.35±0.25 HF 0.07±0.34 0.27±0.22 0.25±0.13 BMSCs 0.61±0.35＊＊▲ 0.45±0.23＊＊ 0.66±0.21＊＊BMSCs+MCA 1.23 ±0.21＊＊# 0.65 ±0.26＊＊# 0.93 ±0.28＊＊#MCA 0.35 ±0.48＊＊

7 Masson結(jié)果

Masson染色后膠原纖維呈藍色線狀，心肌細胞呈紅色，細胞核深藍色。正常組可見少量間質(zhì)纖維化;HF組可見間質(zhì)纖維程度加重。各治療組都還有纖維化存在，但較HF組有所減輕。各治療組組間相比，BMSCs+MCA組纖維化程度最輕，BMSCs組纖維化程度較接近居中，MCA組纖維化程度最重，見圖4。

Figure 4.Myocardial fibrosis was measured by Masson staining(×100).A:normal group;B:HF group;C:MCA group;D:BMSCs group;E:BMSCs+MCA group.圖4 各組心肌組織纖維化程度

討 論

心肌細胞是心臟最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，不論是什么類型的心臟疾病，它所引起的心臟功能的變化，從本質(zhì)上說，都是心肌細胞的變性壞死造成的。針對心力衰竭傳統(tǒng)的藥物治療只能緩解但并不能從根本上阻止病程的發(fā)展;而晚期心力衰竭的病人，心臟移植由于供體來源有限以及移植后產(chǎn)生較強免疫排斥反應的問題，并不能作為有效的治療手段。進行細胞移植，用功能性心肌組織替代宿主受損心肌組織，恢復心臟功能是具有廣泛應用前景的治療策略。因此以挽救、修復和替代心肌細胞為目標的干細胞研究已成為心血管領(lǐng)域的研究熱點［5］。大量研究表明移植細胞在心肌組織的低分布、低存活和低分化影響了治療效果，尤其是長期療效［6］，因此研究者試圖通過各種方法如提高細胞因子水平和改善微環(huán)境等方法提高移植效果［7］。

cAMP是體內(nèi)重要的第二信使，參與細胞的代謝、生長、分化和凋亡等［8］。經(jīng)典的cAMP主要是通過蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)信號通路發(fā)揮作用。研究已證實cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導通路有促進與心肌分化和建立功能相關(guān)的基因如GATA-4、Cx43等表達的作用。MCA為臨床治療心力衰竭的藥物，是一種環(huán)磷酸腺苷類似物，通過與葡甲胺的結(jié)合，增強了cAMP的脂溶性，使其易于透過細胞膜，從而增加細胞內(nèi)cAMP的濃度。我們選取LVEF下降大于20%～30%的大鼠為觀察對象，以超聲心動圖、血流動力學和血清BNP作為心功能評價指標，結(jié)果表明BMSCs移植對心功能有所改善，但改善程度較低，與MCA藥物治療心力衰竭相比對心功能的影響沒有差異，這種結(jié)果與國內(nèi)外學者的研究結(jié)果一致［9-10］。而給予BMSCs移植聯(lián)合MCA共同干預較單獨移植細胞對心功能改善較為明顯。研究表明在細胞移植的早期BMSCs主要分布于肺、肝等血流豐富的器官，隨移植時間延長逐漸歸巢到骨髓定居，2周時達到高峰，此后逐漸向損傷器官如骨骼肌、心肌等定向遷移，并且隨時間延長分布增加［11］。本研究中采用免疫組織化學染色證實，BMSCs可在心肌組織存活，但數(shù)量較少。這與移植細胞的數(shù)量和觀察時間短僅4周有關(guān)系。聯(lián)合給予MCA后，可見BrdU陽性細胞有所增多。因此我們推測移植同時給予MCA能提高BMSCs在心肌組織的存活，這是BMSCs移植聯(lián)合MCA較單獨移植細胞能更好改善心功能的原因之一。

植入細胞能否再生為心肌細胞，是細胞移植研究中備受爭議的問題。新近薈萃分析表明［12］:骨髓細胞移植治療能使心肌梗死和心衰患者的心功能有改善作用，但硬性終點事件并未改善，遠期療效也有爭議。目前雖然少數(shù)研究提示骨髓細胞有向心肌細胞分化的可能，但現(xiàn)在達成的共識是細胞移植的心功能獲益可能來自于通過旁分泌機制促進血管生成、抗心肌凋亡等發(fā)揮作用，而不是通過分化為心肌細胞［13］。本研究觀察到移植BMSCs后心肌組織能表達與心肌細胞分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子GATA-4，還觀察到給予MCA處理的心衰大鼠也能少量表達GATA-4，這可能與心肌損傷后激活心臟自身干細胞并開始分裂有關(guān)。而BMSCs移植聯(lián)合MCA二者共同干預后 GATA-4表達量明顯高于單獨BMSCs或MCA處理組，同時還發(fā)現(xiàn)Cx43、cTNI的表達量也明顯高于其它各組。

以上這些研究結(jié)果是與MCA促進BMSCs向心肌細胞分化有關(guān)，還是與MCA促進BMSCs在心肌組織的存活從而使其發(fā)揮旁分泌作用有關(guān)需要進一步的研究。另外BMSCs和MCA聯(lián)合作用的發(fā)揮是簡單的1+1等于2的作用，還是1+1＞2的作用也值得我們深入研究。

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