劉英超，王銀環(huán)，耿 菲，王建軍，王建輝，張 偉，楊秀紅，△，秦 川

(河北聯(lián)合大學基礎(chǔ)醫(yī)學院1生理教研室，2機能實驗室，河北 唐山 063000;3中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，北京 100021)

目前多數(shù)學者認為高血壓是一種多基因遺傳性疾病，嚴重時可伴有腎損傷。研究發(fā)現(xiàn)，腎素－血管緊張素系統(tǒng)(renin－angiotensin system，RAS)在高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［1］。傳統(tǒng)觀點認為，由血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ，AngⅠ)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin－converting enzyme，ACE)、血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)以及血管緊張素II 1型受體(AT1R)組成的縮血管通路是RAS的主要組成成分。ACE可分解AngⅠ生成AngⅡ，AngⅡ與AT1R結(jié)合，具有促進細胞增殖、增加水鈉潴留、強烈收縮血管等作用。ACE催化的縮血管、通路過度激活參與了高血壓的發(fā)生發(fā)展，然而ACE抑制劑對高血壓的治療效果文獻報道不一［2］。近年來，隨著血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin－converting enzyme 2，ACE2)的發(fā)現(xiàn)及深入研究［3－4］，人們認識到RAS中還存在著另外一條舒血管通路，即AngⅡ－ACE2－Ang(1－7)－Mas受體這一通路。ACE2分解AngⅡ，生成 Ang(1－7)，Ang(1－7)與 Mas受體結(jié)合，具有抗增殖、調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡、舒張血管、降低血壓等作用。有文獻報道稱，高血壓的發(fā)生發(fā)展也與ACE2催化的舒血管通路活性降低有關(guān)［5］。本文研究了ACE/ACE2在血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)－腎素(renin，REN)雙轉(zhuǎn)基因高血壓小鼠腎組織中的表達變化，進而探討RAS穩(wěn)態(tài)失衡在高血壓發(fā)病和腎組織損傷中的意義。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 實驗分為4組，隨機選取野生型(wild type，WT)小鼠、AGT轉(zhuǎn)基因小鼠、REN轉(zhuǎn)基因小鼠以及AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因小鼠各6只，均為雄性C57小鼠，10月齡。其中AGT轉(zhuǎn)基因小鼠和REN轉(zhuǎn)基因小鼠由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供。2種轉(zhuǎn)基因小鼠分別是利用人AGT基因和REN基因啟動子構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切、純化獲得目的基因，通過顯微注射方法建立的人AGT轉(zhuǎn)基因小鼠和人REN轉(zhuǎn)基因小鼠。AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因小鼠由AGT、REN轉(zhuǎn)基因小鼠交配繁殖所得。所有動物均在河北聯(lián)合大學實驗動物中心清潔級動物房飼養(yǎng)繁殖。

1.2 主要儀器 BL－420系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);酶標儀(Model 680，Bio－Rad);電泳儀(ECP3000，北京六一儀器廠);BI2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);光學顯微鏡(Olympus)。

1.3 主要試劑 β－Actin和 ACE2抗體購自Abcam，ACE抗體購自Santa Cruz;免疫組化II抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western封閉液、Western抗兔Ⅱ抗、ECL發(fā)光劑以及顯影定影劑均購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 頸總動脈插管測血壓 10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠后，將其固定在鼠板上，切開頸部皮膚，分離組織，找到并分離頸總動脈，進行插管。插管成功后，開啟BL－420系統(tǒng)，進行血壓監(jiān)測1 h。

2.2 HE染色觀察腎組織病理改變 成功監(jiān)測血壓后，頸動脈放血處死小鼠，迅速取出左側(cè)腎臟置于10%甲醛中固定。之后常規(guī)方法脫水、包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察。

2.3 免疫組化觀察腎組織ACE/ACE2表達 將腎組織石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，3%過氧化氫室溫下孵育10 min，枸櫞酸緩沖液中高溫修復2～3 min，自然冷卻至室溫。滴加Ⅰ抗，37℃孵育1.5 h，PBS沖洗5 min×3次，加入Ⅱ抗試劑Ⅰ37℃孵育15 min，PBS沖洗5 min×3次，加入Ⅱ抗試劑Ⅱ37℃孵育15 min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。利用 BI2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行分析，測定吸光度值，進行統(tǒng)計分析。

2.4 Western blotting觀察腎組織ACE/ACE2表達右側(cè)腎臟取出后，稱取100 mg放入裝有RIPA裂解液的玻璃勻漿器中研磨，離心后取上清測定蛋白濃度。SDS－PAGE電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)至NC膜上。Western封閉液封閉2 h后分別加入兔抗ACE2、βactinⅠ抗(Abcam，1∶1000 稀釋)以及ACEⅠ抗(Santa Cruz，1∶200)，4 ℃孵育過夜。TBST 清洗后，加入羊抗兔Ⅱ抗(碧云天公司，1∶5000稀釋)，室溫孵育30 min。TBST清洗后，滴加ECL發(fā)光劑，進入暗室曝光、顯影、定影。實驗結(jié)果采集之后，利用ImageJ圖像處理軟件對條帶進行分析，測定灰度值，以各組蛋白所得灰度值與β－actin灰度值的比值作為最終結(jié)果，進行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示。組間比較應(yīng)用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 血壓檢測結(jié)果

觀察小鼠動脈插管后20 min、40 min、60 min平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)及脈壓差(pulse pressure，PP)值。結(jié)果顯示:AGT轉(zhuǎn)基因小鼠與野生小鼠相比，MAP無明顯差異(P＞0.05);REN轉(zhuǎn)基因小鼠與野生小鼠相比，MAP降低約15 mmHg(P＜0.05);AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因小鼠與其它3組比較，MAP明顯升高約 30 mmHg(P ＜0.05)。AGT、REN轉(zhuǎn)基因以及AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因小鼠PP值與野生小鼠相比均明顯升高(P＜0.05)，見表1。

表1 不同基因型小鼠血壓測定結(jié)果Table 1.The results of blood pressure in different transgenic mice(mmHg..n=6)

表1 不同基因型小鼠血壓測定結(jié)果Table 1.The results of blood pressure in different transgenic mice(mmHg..n=6)

*P ＜0.05 vs other groups;△P ＜0.05 vs WT mice.

WT 73.81 ±9.68 3.19 ±0.56 77.03 ±9.30 2.91 ±0.30 73.14 ±8.38 3.24 ±0.56 AGT 72.00 ±8.65 7.96 ±2.73△ 70.66 ±9.24 8.32 ±3.23△ 70.15 ±9.25 8.43 ±2.75△REN 61.63 ±7.53△ 6.91 ±2.91△ 57.51 ±10.76△ 7.45 ±2.23△ 56.07 ±9.56△ 7.65 ±3.04△AGT －REN 112.05 ±9.29* 9.20 ±2.64△ 106.66 ±10.24* 8.81 ±3.14△ 104.38 ±10.77* 8.97 ±1.68△

2 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示:與野生小鼠相比，AGT和REN轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織均未見明顯病理改變(因與野生小鼠相比無顯著差異，圖片未提供);而AGTREN雙轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織可見腎小動脈呈增生性內(nèi)膜炎改變，內(nèi)膜顯著增厚，管腔狹窄，管壁增厚，纖維素樣壞死，腎小球纖維化、玻璃樣變，腎小管代償性擴張，可見大量透明管型。腎組織出現(xiàn)了典型的惡性高血壓腎損傷病理表現(xiàn)，見圖1。

Figure 1.The pathological changes of the kidneys(HE staining，×100).A:WT mice;B:AGT －REN mice.圖1 腎臟HE染色結(jié)果

3 免疫組化染色結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果顯示，ACE主要表達于腎小管上皮細胞胞漿中，ACE2主要表達于腎組織近端腎小管上皮細胞的管腔膜。圖像分析結(jié)果顯示，與野生小鼠相比較，AGT和REN轉(zhuǎn)基因鼠腎組織ACE和ACE2表達無明顯變化(P＞0.05);AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因高血壓小鼠腎組織中ACE的表達顯著升高，ACE2表達明顯降低(P ＜0.05)，見圖2～4。

4 Western blotting結(jié)果

Western blotting結(jié)果顯示，與野生小鼠相比，AGT轉(zhuǎn)基因鼠腎組織ACE和ACE2表達變化無明顯差異;REN轉(zhuǎn)基因鼠腎組織ACE表達變化差異不顯著，ACE2表達降低(P＜0.05);AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因鼠ACE表達明顯升高，ACE2表達顯著降低，見圖5A。與野生小鼠相比，AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因鼠腎組織ACE/ACE2比值明顯升高，表達失衡(P＜0.01)，見圖5B。

Figure 2.The results of immunohistochemical staining for ACE in kidneys(×200).A:WT mice;B:AGT mice;C:REN mice;D:AGT －REN mice.圖2 ACE免疫組化染色結(jié)果

Figure 3.The results of immunohistochemical staining for ACE2 in kidneys(×100).A:WT mice;B:AGT mice;C:REN mice;D:AGT－REN mice.圖3 ACE2免疫組化染色結(jié)果

Figure 4.The results of mean absorbance values(by immunohistochemistry)of ACE and ACE2.*P ＜ 0.05 vs WT mice.圖4 ACE和ACE2免疫組化吸光度值分析結(jié)果

Figure 5.Western blotting analysis of ACE and ACE2 protein expression in kidney tissues of different mice.A:the expression of ACE and ACE2 in kidneys;B:the ratio of ACE to ACE2 calculated by ImageJ.*P ＜ 0.05 vs WT and AGT mice;△△P ＜0.01 vs other groups.圖5 Western blotting檢測ACE和ACE2蛋白表達結(jié)果

討 論

基礎(chǔ)和臨床研究均表明，原發(fā)性高血壓是一種多基因遺傳性疾病，其中RAS的基因與高血壓的發(fā)生關(guān)系最為密切，它們在正常血壓的調(diào)控和高血壓的發(fā)病中發(fā)揮非常重要的作用。ACE和ACE2是RAS中重要的組成成分，以往人們只是認為ACE在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用，但隨著ACE2的發(fā)現(xiàn)和深入研究，人們認識到ACE2不僅對血壓調(diào)節(jié)發(fā)揮了重要的作用，而且對高血壓造成的靶器官損害具有保護作用［6］。

本實驗中AGT和REN單轉(zhuǎn)基因小鼠并未見血壓升高，而AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因小鼠可見血壓明顯升高，其原因可能為人血管緊張素原或腎素不能與小鼠內(nèi)源性的RAS系統(tǒng)發(fā)生酶促反應(yīng)，即人的腎素不能水解小鼠的血管緊張素原，小鼠的腎素不能水解人的血管緊張素原，而腎素催化血管緊張素原的反應(yīng)是整個 RAS系統(tǒng)中酶促反應(yīng)的限速步驟［7］。AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)同時含有人AGT和REN基因，使其血漿及組織中AngⅡ水平顯著升高［8－9］，引起嚴重的高血壓。有文獻報道，AngⅡ水平升高可上調(diào)ACE的表達，并且下調(diào)ACE2的表達［10］，本實驗免疫組化結(jié)果和Western blotting均顯示AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織中ACE表達升高，ACE2表達明顯降低，ACE/ACE2表達顯著失衡。ACE具有強烈的縮血管以及促進細胞增殖的作用，雙轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織中其高表達，可能與腎組織內(nèi)膜增生、管壁增厚、管腔狹窄等病理改變的形成密切相關(guān);而具有抗增殖作用的ACE2腎組織內(nèi)低表達，也從另一方面促進了ACE的增殖作用。簡言之，AGT－REN雙轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織內(nèi)ACE/ACE2表達失衡可能是造成其出現(xiàn)典型高血壓病理改變的主要原因。本實驗中另外有趣的發(fā)現(xiàn)是REN轉(zhuǎn)基因小鼠血壓不但沒有升高，反而下降，推測可能是人REN基因的隨機插入影響了血壓調(diào)控位點所致;單轉(zhuǎn)基因和雙轉(zhuǎn)基因小鼠的脈壓差均高于野生型小鼠，可能由于血管彈性降低所致，其機制有待進一步研究。

RAS中，ACE/ACE2兩條通路參與了血壓的調(diào)節(jié)。ACE－AngⅡ－AT1R通路收縮血管升高血壓，造成組織損傷，其機制可能為:(1)強烈的縮血管作用;(2)增加水鈉潴留;(3)增強心肌收縮力，引起心肌纖維化和心肌肥厚;(4)促進細胞增殖，造成組織損傷。ACE2－Ang(1－7)－Mas通路舒張血管降低血壓，在對抗高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［11］。目前認為，ACE2調(diào)節(jié)血壓的作用機制主要有以下幾個方面:(1)分解AngⅡ減弱其升壓作用，并且還可競爭ACE的底物AngⅠ，減少AngⅡ生成;(2)促進Ang(1－7)生成，舒張血管降低血壓;(3)增加一氧化氮(NO)的釋放［NO是強烈的舒血管物質(zhì)，AngⅡ減少可降低NO消耗，Ang(1－7)增多可以促進NO的生成［12］］;(4)調(diào)節(jié)其它血管活性多肽系統(tǒng)。ACE2不僅在血壓調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用，而且對高血壓造成的靶器官損傷也起著保護作用。Huentelman等［13］研究發(fā)現(xiàn)，ACE2的主要產(chǎn)物Ang(1－7)能夠拮抗AngⅡ的作用，抑制心肌重構(gòu)，防止心肌纖維化，對心肌損傷起到保護作用。關(guān)于ACE2對高血壓腎損傷起到保護作用的文獻尚未見報道，但高血壓腎損傷的產(chǎn)生可能是由于AngⅡ大量生成，ACE2水平降低造成的，提高ACE2的活性或者促進ACE2的生成，腎臟損傷情況應(yīng)有所改善。

目前，ACE 抑制劑(ACE inhibitors，ACEI)類藥物已廣泛用于臨床并取得良好效果。Ferrario等［14］研究發(fā)現(xiàn)，給予高血壓大鼠ACEI類藥物后，在血壓下降的同時，心肌ACE2 mRNA水平升高，心肌損傷程度減輕。這提示降低ACE活性，提升ACE2表達水平，促進ACE/ACE2平衡調(diào)節(jié)，可能是ACEI類藥物治療高血壓的作用機制之一。另一方面，體外給予高血壓患者ACE2類藥物或者促進ACE2體內(nèi)合成，進而調(diào)節(jié)ACE/ACE2表達平衡，也能起到降低血壓的效果。Wysocki等［15］也已研究證明，體外給予AngⅡ升高造成的高血壓鼠人重組ACE2蛋白后，可顯著降低血清AngⅡ水平，起到降低血壓的效果。由此可見，ACE2作為抑制高血壓和對靶器官損傷發(fā)揮保護作用的重要物質(zhì)，將會為防治高血壓和其它相關(guān)疾病帶來新的希望。

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