朱琳琳 牛志國(guó) 宋向鳳 陳麗媛 張晨光 王 輝 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，新鄉(xiāng)453003)

從傳統(tǒng)動(dòng)植物中藥資源中開發(fā)抗腫瘤和抗炎癥藥物已成為當(dāng)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)，生物毒素如蝎素等對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用日益受到研究者的關(guān)注。多項(xiàng)研究資料表明，蝎素可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤壞死因子(TNF-α)的分泌，使用藥量顯著減少并可增強(qiáng)其它抗腫瘤藥物的效應(yīng)，蝎素組分Ⅲ(Scorpion venom crudeⅢ，SVC-Ⅲ)就是從河南馬氏鉗蝎素中分離純化出來的一種活性成分［1］。高遷移率族蛋白B1(High mobility group box-1，HMGB1)是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，由單核巨噬細(xì)胞分泌或壞死組織釋放，具有多種功能，參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種重要生命過程，作為良性因子，可以促使骨髓細(xì)胞遷移至皮膚，促進(jìn)表皮細(xì)胞的再生，作為不良因子，在腫瘤血管形成、抑制細(xì)胞凋亡、參與腫瘤侵襲中扮演重要角色［2，3］。截至目前，蝎素與 HMGB1對(duì)免疫細(xì)胞的作用機(jī)制尚未明確。本研究檢測(cè)蝎素對(duì)人單核細(xì)胞系THP1細(xì)胞HMGB1的表達(dá)的影響，試圖探討蝎素對(duì)單核細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制、HMGB1參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制以及蝎素與HMGB1相互作用的關(guān)系，從而為蝎素在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系與質(zhì)粒 人單核細(xì)胞系THP1細(xì)胞購(gòu)自ATCC，pEGFP-N1熒光質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)中心保存。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;SVC-Ⅲ由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分析測(cè)試研究室提供;轉(zhuǎn)染試劑TfxTM-50 Reagent購(gòu)自 Promega公司;Trizol試劑、Taq酶、DNA MarkerⅢ、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京天根公司;反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)購(gòu)自TaKaRa公司;所用引物均為上海英駿生物公司合成;兔抗人HMGB1抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、內(nèi)參β-actin抗體、化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RT-PCR檢測(cè)HMGB1的表達(dá) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP1細(xì)胞離心收集，調(diào)細(xì)胞濃度為1×105ml-1，分裝于24孔板。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、0.1、1.0、10、100 ng/ml的 SVC-Ⅲ組，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA，RT-PCR檢測(cè) HMGB1、GAPDH的 mRNA的表達(dá)，HMGB1引物序列為F:5'-GGCAAGCTTATGGGCAAAGGAGATCCTAA-3'，R:5'-GGCGAATTCTTAATCATCATCATCACTT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度 648 bp，退火 58℃;GAPDH引物序列為F:5'-GCGAGAGGAGCACAGATACC-3'，R:5'-CTGATAGCCTGCTCCAGGTC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度568 bp，退火58℃。電泳圖片用 Band leader 3.0進(jìn)行灰度分析，以目的片段條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映目的基因的表達(dá)量。

1.2.2 Western blot檢測(cè) HMGB1蛋白表達(dá) 設(shè)空白對(duì)照組、0.1、1.0、10、100 ng/ml的 SVC-Ⅲ組，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞的總蛋白，Western blot檢測(cè)HMGB1、β-actin的蛋白表達(dá)情況，采用Quantity-one分析軟件檢測(cè)蛋白條帶相對(duì)灰度值，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 HMGB1-EGFP熒光融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

以THP1的cDNA為模板，擴(kuò)增HMGB1全長(zhǎng)，Trizol試劑提取 THP1細(xì)胞總 RNA，RT-PCR擴(kuò)增HMGB1，所用引物序列為F:5'-GGCAAGCTTTTCATCATCATCATCTTC-3'，R:5'-GAAGATCTATGGGCAAAGGAGATCCTAA-3'，HindⅢ和 EcoRⅠ雙酶切后純化的HMGB1片段與pFLAG-cmv2雙酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性菌落增菌提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，送上海英駿生物公司測(cè)序。

1.2.4 激光共聚焦檢測(cè)HMGB1在細(xì)胞內(nèi)的分布

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、1.0 ng/ml的SVC-Ⅲ組，采用爬片的方法在24孔板中培養(yǎng)THP1細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，將0.5μg pEGFP-HMGB1轉(zhuǎn)染入兩組 THP1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為1.0 ng/ml的SVC-Ⅲ，兩組細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后DAPI染色，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscope，LSCM)檢測(cè)HMGB1在細(xì)胞中的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 SVC-Ⅲ對(duì) THP1細(xì)胞HMGB1 RNA水平表達(dá)的影響 0.1、1.0 ng/ml的 SVC-Ⅲ對(duì) HMGB1 表達(dá)有促進(jìn)作用(P ＜0.05)，其中 1.0 ng/ml SVC-Ⅲ的促進(jìn)作用最強(qiáng)，100 ng/ml SVC-Ⅲ則有明顯抑制作用(P ＜0.05)。見圖1。

2.2 SVC-Ⅲ對(duì)THP1細(xì)胞HMGB1蛋白水平表達(dá)的影響 與RNA結(jié)果一致，0.1、1 ng/ml的 SVC-Ⅲ對(duì)HMGB1蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用(P＜0.05)，其中1.0 ng/ml SVC-Ⅲ的促進(jìn)作用最強(qiáng)，100 ng/ml SVC-Ⅲ則有明顯抑制作用(P＜0.05)。見圖2。

2.3 HMGB1-EGFP熒光融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SGC7901細(xì)胞，激光共聚焦檢測(cè)表達(dá)效果，綠色熒光非常明顯。見圖3。

圖1 SVC-Ⅲ對(duì)HMGB1基因表達(dá)的影響Fig.1 Effect of SVC-Ⅲ on RNA expression of HMGB1

圖2 SVC-Ⅲ對(duì)HMGB1蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of SVC-Ⅲ on protein expression of HMGB1

圖3 激光共聚焦檢測(cè)p EGFP-HMGB1的SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)(×400)Fig.3 The expression of p EGFP-HMGB1 in SGC7901 detected by LSCM(×400)

圖4 SVC-Ⅲ對(duì)THP1細(xì)胞HMGB1分布情況的影響(×400)Fig.4 Effect of SVC-Ⅲ on distribution of HMGB1(×400)

2.4 SVC-Ⅲ對(duì)THP1細(xì)胞HMGB1分布情況的影響HMGB1-EGFP熒光融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，激光共聚焦檢測(cè)HMGB1表達(dá)分布情況:空白對(duì)照組，HMGB1存在于胞核中;1.0 ng/ml的 SVC-Ⅲ組，由于SVC-Ⅲ的刺激作用，HMGB1從胞核中轉(zhuǎn)移入胞漿。見圖4。

3 討論

近年來，蝎素作為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的研究日益增多，它可以改善荷瘤機(jī)體細(xì)胞免疫功能的抑制狀態(tài)，發(fā)揮抗腫瘤作用［1］。SVC-Ⅲ能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤壞死因子的分泌，能以劑量依賴的方式調(diào)節(jié)Jurkat細(xì)胞中信號(hào)分子ZAP-70和LAT的表達(dá)［4］。HMGB1作為單核巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其功能具有兩面性。一方面可以引起骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)移，促進(jìn)表皮細(xì)胞再生，發(fā)揮其良性作用，另一方面還可以促進(jìn)血管生成因子的分泌，參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲［5］。已有報(bào)道，HMGB1參與了腫瘤、自身免疫病、敗血癥等多種疾病的病理生理過程［6］。HMGB1是否可以成為抗炎抗腫瘤治療的新的切入點(diǎn)，已成為目前的研究熱點(diǎn)。

截至目前，蝎素與HMGB1對(duì)免疫細(xì)胞的作用機(jī)制尚未明確。本研究就以人單核細(xì)胞系THP1細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用不同濃度SVC-Ⅲ對(duì)其進(jìn)行刺激，48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞HMGB1的表達(dá)。結(jié)果顯示，0.1 ng/ml和1.0 ng/ml SVC-Ⅲ對(duì) HMGB1 轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達(dá)水平有明顯的促進(jìn)作用，其中1.0 ng/ml SVC-Ⅲ的促進(jìn)作用最強(qiáng)，但隨著濃度的增高，100 ng/ml SVC-Ⅲ則顯示出抑制作用。除HMGB1之外，我們之前研究結(jié)果還表明0.1 ng/ml和1.0 ng/ml SVC-Ⅲ對(duì)THP1細(xì)胞p65、IKK1的表達(dá)也有促進(jìn)作用，而100 ng/ml時(shí)則表現(xiàn)出明顯的抑制作用［7］。

不同濃度SVC-Ⅲ對(duì)THP1細(xì)胞HMGB1 RNA與蛋白表達(dá)會(huì)產(chǎn)生不同的影響，本研究結(jié)果也已顯示1 ng/ml SVC-Ⅲ可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量的HMGB1，那么產(chǎn)生的HMGB1又是通過什么途徑來對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生功能影響呢?針對(duì)此，我們應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)，發(fā)現(xiàn)HMGB1作為核蛋白，在不受任何刺激的情況下，主要是存在于胞核內(nèi)的，但接受SVC-Ⅲ刺激以后，HMGB1則從胞核轉(zhuǎn)移入胞漿。這也印證了以往一些研究結(jié)果:HMGB1可由單核、巨噬細(xì)胞主動(dòng)地分泌出細(xì)胞，當(dāng)HMGB1位于細(xì)胞外時(shí)，可與晚期糖基化終產(chǎn)物受體、Toll樣受體2和Toll樣受體4等多種受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)多種炎性因子的表達(dá)，發(fā)揮其生物學(xué)功能［8，9］。

總之，本研究表明SVC-Ⅲ能影響HMGB1的表達(dá)及在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移，而且功能的發(fā)揮與其劑量關(guān)系密切。在臨床應(yīng)用中，如創(chuàng)傷修復(fù)的病人可以選擇低濃度SVC-Ⅲ，從而升高其HMGB1水平，促進(jìn)表皮細(xì)胞再生;而腫瘤等病人則可選擇較高濃度SVC-Ⅲ，從而抑制其HMGB1表達(dá)，起到抗炎抗腫瘤的效果。本研究為蝎素在疾病治療中的應(yīng)用，提供了一定的理論依據(jù)，臨床應(yīng)用應(yīng)根據(jù)具體病情以及治療目的，選擇適合的濃度，以期達(dá)到預(yù)期效果。

1 王 輝，董 珂，孫書明 et al.蝎素SVC-Ⅲ對(duì)荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及TNF-α水平的影響［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2002;18(5):505-506.

2 Katsuto Tamai，Takehiko Yamazaki，Takenao Chino et al.PDGFRαpositive cells in bone marrow are mobilized by high mobility group box 1(HMGB1)to regenerate injured epithelia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011;108(16):6609-6614.

3 Ulloa L，Messmer D.High-mobility group box 1(HMGB1)protein:Friend and foe［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2006;17(3):189-201.

4 宋向鳳，郭繼強(qiáng)，白國(guó)強(qiáng) et al.蝎素組分 對(duì) Jurkat細(xì)胞 CCR5表達(dá)的影響［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009;25(3):221-222.

5 Tang D，Kang R，Zeh H J et al.High mobility group box 1 and cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2010;1799(12):131-140.

6 Sims G P，Rowe D C，Rietdijk S T et al.HMGB1 and RAGE in inflammation and cancer［J］.Annu Rev Immunol，2010;28:367-388.

7 宋向鳳，孫愛平，牛志國(guó) et al.蝎素組分Ⅲ對(duì)THP1細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的影響［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2011;27(1):34-36.

8 Park JS，Robertson F，He Q et al.High mobility group box 1 protein interacts with multiple Toll-like receptors［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2006;290(3):917-924.

9 Yan S F，Ramasamy R，Schmidt A M.Receptor for AGE(RAGE)and its ligands-cast into leading roles in diabetes and the inflammatory response［J］.J Mol Med，2009;87(3):235-247.