丁涵露，王 莉，汪 偉，鄒玉榮，廖常志，張 萍

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 成都 610072)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)病機(jī)制不完全清楚，炎癥機(jī)制在DN發(fā)病中的作用正得到重視，而機(jī)體內(nèi)源性抗炎機(jī)制目前研究較少。法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)是一種重要的核受體，除參與膽固醇、脂類和葡萄糖等物質(zhì)代謝過程外［1，2］，還具有重要抗炎作用［3］。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)腎組織引發(fā)的炎癥反應(yīng)是造成DN病變持續(xù)進(jìn)展的重要機(jī)制［4］，有關(guān)人類DN腎組織FXR表達(dá)及其與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、腎損傷之間的關(guān)系目前未見報(bào)道，因此，明確FXR在糖尿病腎病腎組織中的表達(dá)及其與炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腎損傷之間的關(guān)系將有助于明確DN炎癥反應(yīng)的調(diào)控。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 試驗(yàn)對(duì)象15例均為我院2005～2011年住院DN患者(DN組)，其中男7例，女8例，年齡(54±8.5)歲，均經(jīng)腎活檢組織病理檢查確診為DN。正常組5例，年齡(52±6.9)歲，來(lái)自我院腎腫瘤做腎切術(shù)但遠(yuǎn)離腫瘤部位的腎組織，均經(jīng)光鏡證實(shí)腎組織正常。

1.2 材料 兔抗人FXR多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Ebioscience公司，小鼠抗人CD68單克隆抗體、超敏SP(鼠/兔)免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉公司。

1.3 FXR、CD68免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片4 μm，常規(guī)脫蠟、水洗后，3%H2O2室溫 15 min，F(xiàn)XR行EDTA微波修復(fù)，CD68行胰酶修復(fù)，分別滴加一抗:兔抗人FXR多克隆抗體(稀釋比例為1∶200)和小鼠抗人CD68抗體原液，4℃過夜。次日0.01 mol/L PBS洗5 min×3次后，即按照超敏SP免疫組化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。陰性對(duì)照以PBS代替一抗，同法操作。

1.4 腎小球病理?yè)p害程度的判定 石蠟切片行HE、PAS等常規(guī)染色，PAS染色切片在200倍視野下進(jìn)行分析，每張切片選擇10個(gè)正切的腎小球，計(jì)算系膜區(qū)擴(kuò)張指數(shù)(以系膜區(qū)/毛細(xì)血管襻面積比表示)，取平均值作為每個(gè)標(biāo)本的系膜區(qū)擴(kuò)張指數(shù)［5］。

1.5 腎小管-間質(zhì)病理?yè)p害程度的判定 根據(jù)腎小管擴(kuò)張程度、腎小管萎縮程度、腎小管上皮細(xì)胞空泡變性程度、腎小管上皮細(xì)胞壞死程度、間質(zhì)纖維化程度及腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度的無(wú)、輕、中、重分別計(jì)0、1、2、3，每例樣本觀察10個(gè)視野，結(jié)果以每例樣本的相加總和平均值表示［6］。

1.6 FXR、CD68陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果判斷

1.6.1 FXR免疫組化表達(dá) 采用半定量法分析，由兩人在事先不知道標(biāo)本臨床指標(biāo)和腎臟病理結(jié)果的情況下同時(shí)閱片。陽(yáng)性評(píng)分方法:①按陽(yáng)性范圍記分:無(wú)為0分，＜25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;②按陽(yáng)性程度記分，0分:無(wú)染色;1分:弱陽(yáng)性;2分:中度陽(yáng)性;3分:強(qiáng)陽(yáng)性;4分:極強(qiáng)陽(yáng)性。③陽(yáng)性范圍和陽(yáng)性程度的評(píng)分相乘結(jié)果，即該例的陽(yáng)性積分［7］。

1.6.2 CD68表達(dá)觀察 每例標(biāo)本選取皮質(zhì)腎小管-間質(zhì)10個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)［7］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)計(jì)量資料采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。FXR陽(yáng)性表達(dá)積分與CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、臨床指標(biāo)和腎組織病理變化的相關(guān)分析用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常組和DN組年齡［(52±6.9)歲 vs(54±8.5)歲］、內(nèi)生肌酐清除率［(99.7±10.1)ml/(min·1.73m2)vs(92.4±9.7)ml/(min·1.73m2)］差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而DN組患者尿蛋白、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)和甘油三酯(TG)水平以及系膜區(qū)擴(kuò)張指數(shù)和腎小管病變積分明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，見表1。

表1 兩組研究對(duì)象臨床特征及腎臟病理比較

2.2 FXR和CD68在腎組織中的表達(dá) 在正常和DN腎組織中，腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞、近端腎小管上皮細(xì)胞、遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞及集合管上皮細(xì)胞均表達(dá)FXR(圖1a、圖2a，表2)，免疫組化陽(yáng)性染色顆粒主要位于細(xì)胞漿中，表達(dá)強(qiáng)度正常組較DN組弱。CD68在正常腎組織的腎間質(zhì)和腎小球無(wú)明顯表達(dá)(圖1b，表2)，而在DN腎小球和腎小管間質(zhì)均有CD68表達(dá)(圖2b，表2)，陰性對(duì)照未見FXR和CD68陽(yáng)性染色。

圖1 FXR(a)和CD68(b)在正常腎組織中的表達(dá)(免疫組化×200);圖2 FXR(a)和CD68(b)在糖尿病腎病腎組織表達(dá)增強(qiáng)(a免疫組化×200;b免疫組化×400)

表2 FXR和CD68在腎小球、腎小管-間質(zhì)內(nèi)陽(yáng)性強(qiáng)度積分比較

2.3 FXR陽(yáng)性表達(dá)積分與CD68陽(yáng)性+細(xì)胞積分和臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性分析 腎組織內(nèi)FXR陽(yáng)性表達(dá)積分與CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及LDL和TG水平呈負(fù)相關(guān)(r分別為－0.742、－0.654、－0.632，P 均＜0.01);FXR陽(yáng)性表達(dá)積分與腎小球系膜擴(kuò)張指數(shù)和腎小管-間質(zhì)病變呈負(fù)相關(guān)(r分別為－0.587、－0.636，P均＜0.01)，與24小時(shí)尿蛋白定量無(wú)相關(guān)性。

3 討論

FXR是核受體家族成員中一種重要的核受體，在正常肝臟、腎臟和小腸高表達(dá)，初級(jí)膽酸是FXR親和力最強(qiáng)的內(nèi)源性配體。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腎小球膜細(xì)胞中FXR過度表達(dá)或是以人工合成配體GW4064激活FXR后，能抑制系膜細(xì)胞上固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)及其他生脂基因轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β和白細(xì)胞介素(IL-6)的表達(dá)，從而減輕系膜細(xì)胞的脂質(zhì)和炎癥損害［8］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR主要表達(dá)在系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，DN腎組織FXR表達(dá)較正常腎組織增強(qiáng)，且與腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張指數(shù)負(fù)相關(guān)，推測(cè)DN患者系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加，F(xiàn)XR代償性表達(dá)增加以抑制系膜基質(zhì)增加。內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞損害也是促進(jìn)DN病變進(jìn)展的重要機(jī)制，有報(bào)道FXR可在足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)［8］，在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)少量FXR在足細(xì)胞和腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞位置表達(dá)，可能與其抗炎反應(yīng)有關(guān)。本試驗(yàn)中，腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)FXR在DN組織較正常組織增強(qiáng)，F(xiàn)XR陽(yáng)性積分與腎小管間質(zhì)病變呈負(fù)相關(guān)，提示FXR可能參與了腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)和纖維化的病變。

DN存在明顯脂代謝紊亂，脂質(zhì)在腎小球沉積可引起腎小球單核細(xì)胞浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞和含膽固醇/膽固醇酯細(xì)胞增多，系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)積聚，在表現(xiàn)為I型DN的C57BL/6鼠，當(dāng)FXR基因敲除后，腎損害較野生型糖尿病C57BL/6小鼠明顯加重，而給予DBA/2J小鼠FXR激動(dòng)劑INT-747后，腎組織脂質(zhì)沉積減少，尿蛋白、腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化、氧化應(yīng)激減輕，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少，F(xiàn)XR配體通過激活A(yù)kita和OVE26小鼠腎組織FXR及FXR靶基因小異源二聚體伴侶受體 SHP，抑制SREBP-1和PPARalpha活性，減少脂肪酸、甘油三酯在腎組織的沉積，從而減輕蛋白尿和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，說(shuō)明FXR具有通過調(diào)節(jié)脂代謝而保護(hù)腎組織的作用［8］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，DN患者血 LDL、TG較正常組升高，腎組織FXR表達(dá)增加，其陽(yáng)性積分與血LDL、TG呈負(fù)相關(guān)，提示腎組織表達(dá)FXR增加以加強(qiáng)對(duì)LDL、TG的清除，減輕脂質(zhì)沉積增加所引起的腎損害，但需要進(jìn)一步觀察腎組織脂質(zhì)沉積和FXR及其靶信號(hào)通路SREBP-1等的表達(dá)，以明確FXR在DN脂質(zhì)腎損害中的作用。

FXR除參與膽固醇、脂類和葡萄糖等物質(zhì)代謝過程外［1，2］，還具有重要抗炎作用［3］，其在抑制多種器官的炎癥以及全身性炎癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［9～11］。炎癥反應(yīng)在DN發(fā)病機(jī)制中占有重要位置，浸潤(rùn)于腎組織的巨噬細(xì)胞通過釋放炎性介質(zhì)，在DN中起著重要的致病作用［12］，與蛋白尿程度及腎功能衰退密切相關(guān)［13］，因此，本研究擬通過觀察FXR表達(dá)和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68表達(dá)，探討FXR與DN炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DN腎組織較正常腎組織，F(xiàn)XR和CD68表達(dá)均增加，相關(guān)分析顯示，DN腎組織FXR陽(yáng)性表達(dá)積分和CD68陽(yáng)性表達(dá)積分呈負(fù)相關(guān)。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)FXR不僅抑制炎癥反應(yīng)，而且FXR的活化可在轉(zhuǎn)錄水平抑制NF-KB誘導(dǎo)的炎癥因子，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、干擾素誘導(dǎo)蛋白10和干擾素 r的表達(dá)［9］，下調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)［2］，因此本研究中表達(dá)增強(qiáng)的FXR有可能通過抑制MCP-1表達(dá)而抑制巨噬細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)，減輕炎癥反應(yīng)和腎損害加重，而且在炎癥刺激下，F(xiàn)XR的活性及表達(dá)水平被抑制［1］，因此炎癥反應(yīng)和FXR相互影響而參與DN炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，其具體病理生理意義還需要研究。

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