林 占 薛耀明 關(guān)美萍

1.廣東省惠州市中心人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 惠州 516001；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，廣東 廣州 510515

高糖分為持續(xù)性高糖及波動性高糖，研究發(fā)現(xiàn)波動性高糖同樣可以導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素分泌功能的損傷[1-2]，其機(jī)制并未完全研究清楚。細(xì)胞ATP是近年來研究的熱點(diǎn)，近年來發(fā)現(xiàn)胰島素的分泌和胰島β細(xì)胞內(nèi)的ATP含量關(guān)系密切[3-4]。本實(shí)驗(yàn)擬用含不同葡萄糖濃度及是否含抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）的培養(yǎng)液干預(yù)INS-1細(xì)胞，通過比較持續(xù)性高糖及波動性高糖對ATP生成的影響及影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640-培養(yǎng)基購自GIBAO，胎牛血清購自上海微科生化試劑有限公司，N-乙酰半胱氨酸及ATP檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞貼壁生長于含有10%胎牛血清、0.6 mol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1 mmol/L丙酮酸鈉、50 mol/L 2-巰基乙醇的普通RPMI 1640-培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將INS-1細(xì)胞隨機(jī)分為正常糖組（5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)）、持續(xù)高糖組（16.7 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)）、波動組（用16.7 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，再換5.5 mmol/L培養(yǎng)3 h，每天重復(fù)3次，夜間9 h維持在5.5 mmol/L的培養(yǎng)液中）、NAC+正常糖組、NAC+持續(xù)高糖組、NAC+波動組，后3組的培養(yǎng)基中均預(yù)先負(fù)載終濃度為1.0 mmol/L NAC，余干預(yù)措施相同，均干預(yù)72 h。每組5個培養(yǎng)皿。各組每日均同時更換培養(yǎng)基以保持相同的處理?xiàng)l件，培養(yǎng)基事先恒溫箱37℃水浴，以減少對細(xì)胞的損傷。

1.2.3 測定的指標(biāo)及方法 分組干預(yù)結(jié)束后，用熒光素酶法檢定細(xì)胞ATP含量，分別用2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖各刺激INS-1細(xì)胞1 h，收集上清后放免法測定其胰島素分泌水平，分別作為基礎(chǔ)和高糖刺激下胰島素釋放，計(jì)算高糖刺激胰島素分泌/基礎(chǔ)胰島素分泌作為胰島素分泌能力結(jié)果。結(jié)果均以胰島細(xì)胞總蛋白校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，各組內(nèi)均數(shù)比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，若方差不齊采用Welch近似方差分析；多重比較采用LSD法（Least-significant difference test），兩兩比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葡萄糖及抗氧化劑對INS-1細(xì)胞胰島素分泌水平的影響

六組基礎(chǔ)胰島素分泌（2.8 mmol/L葡萄糖刺激）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高糖刺激胰島素分泌（16.7 mmol/L葡萄糖刺激）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 六組INS-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌及高糖胰島素分泌(，n=5）

表1 六組INS-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌及高糖胰島素分泌(，n=5）

組別基礎(chǔ)胰島素分泌（2.8 mmol/L葡萄糖刺激）（μU/μg protein)高糖刺激胰島素分泌（16.7 mmol/L葡萄糖刺激）（μU/μg protein)正常糖組高糖組波動組NAC+正常糖組NAC+高糖組NAC+波動組F值P值6.21±0.73 5.89±1.18 5.85±1.04 6.12±0.84 5.93±0.84 6.03±0.89 0.115 0.988 22.91±2.18 16.55±2.13 12.73±2.48 22.41±3.05 19.71±2.01 19.50±2.51 13.365 0

2.2 不同濃度葡萄糖及抗氧化劑對INS-1細(xì)胞ATP含量及胰島素分泌能力的影響

由表2可知，與正常糖組相比，持續(xù)性高糖組及波動組的胞內(nèi)ATP含量及胰島素分泌能力顯著下降（P＜0.01），且波動組下降更明顯。使用抗氧化劑NAC干預(yù)持續(xù)性高糖組及波動組，兩組的細(xì)胞ATP含量及胰島素分泌能力均較未使用組顯著增加（P＜0.05）。

3 討論

近年來，血糖波動的危害越來越受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)波動性高血糖不僅促進(jìn)糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[5-7]，也可損傷β細(xì)胞的胰島素分泌功能[1-2]。本研究發(fā)現(xiàn)，波動性高糖及持續(xù)性高糖均可損傷INS-1細(xì)胞的胰島素分泌能力，且波動性高糖更嚴(yán)重。

已有研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞胰島素分泌與ATP合成相偶聯(lián)[3-4]。葡萄糖刺激胰島素分泌的重要機(jī)制是葡萄糖增加ATP的合成，減少游離二磷酸腺苷，導(dǎo)致ATP敏感性K+通道關(guān)閉，細(xì)胞去極化，Ca2+通過鈣電壓門控通道內(nèi)流，并產(chǎn)生一系列的級聯(lián)放大效應(yīng)使胰島素分泌顆粒胞吐，胰島素分泌到細(xì)胞外[4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATP含量在持續(xù)性高糖組及波動組均較正常糖組顯著下降，且波動組下降更明顯。本研究提示，波動性高糖及持續(xù)性高糖可能通過降低INS-1細(xì)胞的ATP生成降低其胰島素分泌能力，且波動性高糖更嚴(yán)重。

表2 六組INS-1細(xì)胞ATP含量及胰島素分泌能力的比較（，n=5）

表2 六組INS-1細(xì)胞ATP含量及胰島素分泌能力的比較（，n=5）

注：與正常糖照組比較，■P＜0.01；與持續(xù)高糖組比較，▲P＜0.05；與波動組比較，◆P＜0.01

組別 ATP含量 胰島素分泌能力（nmol/mg protein） （高糖/基礎(chǔ)）正常糖組47.058±4.5353.702±0.277持續(xù)高糖組35.950±3.911■2.843±0.251■波動組28.816±3.772■▲2.188±0.265■▲NAC+正常糖組48.014±5.0183.668±0.214 NAC+持續(xù)高糖組41.624±3.543▲3.342±0.178▲NAC+波動組41.042±3.794◆3.246±0.195◆

高糖可引起胰島β細(xì)胞功能紊亂，胰島素分泌功能受損，其機(jī)制較復(fù)雜。近年來大量文獻(xiàn)證實(shí)氧化應(yīng)激在β細(xì)胞的損傷中發(fā)揮的重要作用[8]。胰島β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞株表達(dá)氧自由基清除酶少，對氧化應(yīng)激損傷高度敏感，本實(shí)驗(yàn)采用該細(xì)胞株進(jìn)行研究。已有多篇文獻(xiàn)證實(shí)抗氧化劑NAC能夠保護(hù)胰島β細(xì)胞的分泌功能[9]，本研究用NAC處理后發(fā)現(xiàn)，NAC+波動組及NAC+持續(xù)高糖組的細(xì)胞ATP含量及胰島素分泌能力分別較波動組及持續(xù)高糖組顯著增加，抗氧化劑可以顯著改善細(xì)胞ATP及胰島素分泌能力，提示波動性高糖及持續(xù)性高糖導(dǎo)致ATP合成減少可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述，波動性高糖及持續(xù)性高糖可能通過氧化應(yīng)激使ATP合成減少，且波動性高糖的程度更嚴(yán)重，最終導(dǎo)致INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的損傷。這為以后改善ATP合成以減少β細(xì)胞高糖毒性提供更多的理論依據(jù)。但波動性高糖及持續(xù)性高糖使ATP合成減少的許多具體機(jī)制仍未證實(shí)，有待進(jìn)一步的研究。

[1]Hou ZQ，Li HL，Gao L，et al.Involvement of chronic stresses in rat islet and INS-1 cell glucotoxicity induced by intermittent high glucose[J].Mol Cell Endocrinol，2008，291(1-2)：71-78.

[2]Qiu P，Zhao TY，Li XJ， et al.Damage mechanism of intermittent exposure to high concentrations of glucose to beta cell lines(HIT-T15 cell)[J].Sichuan Da Xue Xue Bao：Yi Xue Ban，2008，39(1)：69-71，93.

[3]Maechler P，Wang H，Wollheim CB.Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase[J].FEBS Lett，1998，422(3)：328-332.

[4]Rutter GA.Visualising insulin secretion.The Minkowski Lecture 2004[J].Diabetologia，2004，47(11)：1861-1872

[5]Azuma K，Kawamori R，Toyofuku Y，et al.Repetitive fluctuations in blood glucose enhance monocyte adhesion to the endothelium of rat thoracic aorta[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(10)：2275-2280.

[6]Yano M，Hasegawa G，Ishii M，et al.Short-term exposure of high glucose concentration induces generation of reactive oxygen species in endothelial cells：implication for the oxidative stress associated with postprandial hyperglycemia[J].Redox Rep，2004，9(2)：111-116.

[7]Madsbad S，Brock B，Schmitz O，et al.Postprandial hyperglycemia.Postp-randial blood glucose fluctuations，cardiovascular disease and late diabetic complications[J].Ugeskr Laeger，2003，165(33)：3149-3153.

[8]Robertson R，Zhou H，Zhang T，et al.Chronic oxidative stress as a mechanism for glucose toxicity of the beta cell in type 2 diabetes [J].Cell Biochem Biophys，2007，48(2-3)：139-146.

[9]Tanaka Y，Gleason CE，Tran PO，et al.Prevention of glucose toxicity in HIT-T15 cells and Zucker diabetic fatty rats by antioxidants [J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(19)：10857-10862.