焦炳欣 華文浩 陳志海 李興旺 楊曉玲 何艷群 周 淳 周 茹 郭 杰

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院，北京 100015

瘧疾是由瘧原蟲(chóng)感染引起的危害嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病，我國(guó)曾將瘧疾發(fā)病控制在較低水平[1]，2000年以來(lái)，瘧疾疫情出現(xiàn)回升，目前防治工作依然十分嚴(yán)峻。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷對(duì)有效治療瘧疾及控制其流行具有重要意義[2]。本研究通過(guò)對(duì)疑似瘧疾患者血樣用鏡檢法、OptiMAL法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行瘧原蟲(chóng)的檢測(cè)，并將快速免疫層析法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與傳統(tǒng)鏡檢法做比較，旨在探討瘧原蟲(chóng)對(duì)抗瘧藥體外敏感性監(jiān)測(cè)的方法，為指導(dǎo)臨床抗瘧藥的合理使用提供支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

67份血樣來(lái)自2010年1月～2012年3月來(lái)我院就診的瘧區(qū)發(fā)熱患者。每份血樣分別涂制厚薄血片后留存血樣，-20℃低溫保存。樣本采集均為靜脈取血，2%EDTA-Na2抗凝。

1.2 儀器與試劑

ABI PRISM7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 （美國(guó)ABI公司）。瘧原蟲(chóng)核酸測(cè)定試劑盒。惡性、間日瘧、卵形瘧原蟲(chóng)核酸測(cè)定試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）。單克隆抗體免疫層析試劑盒（OptiMAL-IT）（瑞士DiaMed生物醫(yī)藥公司）。

1.3 方法

1.3.1 鏡檢方法

每份血樣均涂制厚薄血膜各1張，吉氏染色。高倍鏡下觀察血涂片，并計(jì)數(shù)蟲(chóng)體密度。瘧原蟲(chóng)的密度＝瘧原蟲(chóng)數(shù)÷白細(xì)胞數(shù)×患者每微升血中白細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 單克隆抗體免疫層析試劑盒OptiMAL法（以下稱(chēng)OptiMAL法）

將患者全血點(diǎn)樣到試劑盒的點(diǎn)樣孔上，樣品將沿纖維膜向上移動(dòng)，如樣品中含有惡性虐乳酸脫氫酶或者其他瘧疾乳酸脫氫酶，將會(huì)與特定位置的單克隆抗體結(jié)合并發(fā)出顏色，結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)為僅在控制線處出現(xiàn)反應(yīng)帶表明實(shí)驗(yàn)成功且為陰性，在控制線和瘧疾反應(yīng)帶處同時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)為瘧疾陽(yáng)性。

1.3.3 熒光定量PCR方法

參照瘧原蟲(chóng)核酸測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒采用聚合酶式反應(yīng)（PCR）技術(shù)結(jié)合熒光探針技術(shù)，對(duì)瘧原蟲(chóng)特異性核酸片段進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。

1.3.3.1 瘧原蟲(chóng)DNA提取 全血標(biāo)本取100 μL（震蕩混勻10 s）分別加入100 μL核酸提取液，震蕩10 s，99℃干浴10 min，13000 r/min離心10 min，保留上清備用。同時(shí)將陽(yáng)性對(duì)照品進(jìn)行10、100、1000倍梯度稀釋?zhuān)瑐溆谩?/p>

1.3.3.2 熒光定量PCR檢測(cè) 熒光反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀上，循環(huán)參數(shù)設(shè) 37℃×2 min；94℃×2 min；再按 93℃×15 s→60℃×60 s，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃。反應(yīng)體系為40 μL。上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.3.3 DNA含量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束儀器根據(jù)其濃度自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。循環(huán)閾值（Ct值）與起始模板量呈直線負(fù)相關(guān)。根據(jù)檢測(cè)樣品的Ct值，即能求出起始DNA的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種不同方法檢出率比較

67例疑似瘧疾來(lái)我院就診的患者中，鏡檢檢出瘧原蟲(chóng)38例 （56.7%）；OptiMAL法檢出瘧原蟲(chóng)35例 （52.2%），PCR法檢出瘧原蟲(chóng)42例（62.7%）；經(jīng)卡方檢驗(yàn)，3種檢測(cè)方法定性判斷結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.471）。

2.2 臨床特征結(jié)合實(shí)驗(yàn)室與PCR技術(shù)檢出率比較

在上述瘧疾陽(yáng)性患者中，經(jīng)臨床特征結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診28例為惡性瘧，14例為間日瘧，PCR技術(shù)檢出惡性瘧28例，間日瘧14例，符合率為100%。

2.3 三種方法的分析性能評(píng)價(jià)

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)3種方法的分析性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。見(jiàn)表1。

表1 三種方法的分析性能評(píng)價(jià)（%）

2.4 OptiMAL法治療效果的考核

28例惡性瘧和14例間日瘧患者經(jīng)常規(guī)治療24 h、3 d、1周后分別采血考核治療效果，治療3 d后部分患者陰轉(zhuǎn)，但治療1周后所有患者均表現(xiàn)為陰性，表明未出現(xiàn)耐藥株（圖1）。

圖1 瘧疾患者服藥后24 h、3 d和1周用OptiMAL法考核效果

2.5 鏡檢法（蟲(chóng)體密度/μL）治療效果考核

42例瘧疾患者在治療前，治療后24 h、3 d、1周和2周后瘧原蟲(chóng)的蟲(chóng)體密度分別為 6.1×105/μL，9.2×105/μL，100/μL<50/μL（陰性），<50/μL（陰性）。

2.6 PCR法治療效果的考核

監(jiān)測(cè)42例瘧疾患者治療前，治療后24 h、3 d、1周和2周后瘧原蟲(chóng)的核酸含量分別為 2.7×107、2.1×105、4.27×103、2.92×102、33 copies/mL。患者血中核酸含量伴隨病情逐漸好轉(zhuǎn)呈下降趨勢(shì)，可作為停藥的依據(jù)。

3 討論

檢出瘧原蟲(chóng)是瘧疾明確診斷的最直接證據(jù)。目前最常用的是顯微鏡檢查法，但由于瘧區(qū)人群普遍服用抗瘧藥物而影響了原蟲(chóng)正常形態(tài)[3]，造成對(duì)外周血瘧原蟲(chóng)有很強(qiáng)的抑制作用；同時(shí)低原蟲(chóng)血癥和混合感染患者的增多使傳統(tǒng)的瘧疾診斷方法不能適應(yīng)現(xiàn)代瘧疾監(jiān)控的要求，一些對(duì)傳統(tǒng)方法的改進(jìn)及新的診斷技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。目前瘧疾的監(jiān)測(cè)方法包括病原學(xué)診斷即顯微鏡厚/薄血片的檢查、免疫學(xué)檢查即快速免疫診斷試條和病原基因診斷[4]即實(shí)時(shí)定量PCR法等。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種方法對(duì)瘧疾陽(yáng)性檢出率無(wú)顯著差異，但PCR法敏感性最高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：PCR檢測(cè)的敏感度可達(dá)1個(gè)原蟲(chóng)/μL；鏡檢法最低檢出限為3～4個(gè)/萬(wàn)紅細(xì)胞，而OptiMAL法最低檢出限為10～20個(gè)/L血（含350萬(wàn)～600萬(wàn)紅細(xì)胞）[5]，在本研究中，當(dāng)原蟲(chóng)密度較低（<50/μL）時(shí)，即在瘧疾處于較低水平的原蟲(chóng)血癥時(shí)，靠鏡檢法難以查到，容易出現(xiàn)漏診，而用PCR法可彌補(bǔ)這一不足。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瘧原蟲(chóng)3種檢測(cè)方法的特異性無(wú)明顯差異。但檢測(cè)中有兩例鏡檢法為陰性，而OptiMAL法與PCR法檢測(cè)結(jié)果一致，均為陽(yáng)性。原因可能是瘧原蟲(chóng)在藥物治療前，在紅細(xì)胞中形態(tài)完整，且有一定的密度，鏡檢法可檢出；一旦藥物治療后，瘧原蟲(chóng)被裂解、破壞、分解，其形態(tài)遭到破壞，此時(shí)用染色鏡檢法很難診斷，而以分子形式存在血液中的乳酸脫氫酶則仍可被檢出，直至血液中的瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶被分解代謝。

OptiMAL法的原理是利用乳酸脫氫酶（LDH）單克隆抗體捕獲溶血中的LDH抗原的免疫層析技術(shù)[6-7]。由于血液中LDPH與蟲(chóng)體血癥呈平行相關(guān)，同時(shí)瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶作為原蟲(chóng)的一種特殊形式的循環(huán)抗原與人紅細(xì)胞和其他物質(zhì)的乳酸脫氫酶具有顯著不同的物理生化特性，易于區(qū)分，可作為瘧原蟲(chóng)存在的標(biāo)志物。從表中可知瘧原蟲(chóng)患者在治療3 d部分患者出現(xiàn)陰轉(zhuǎn)，但治療1周后所有患者均表現(xiàn)為陰性反應(yīng)。原因是OptiMAL法可反映藥物治療后原蟲(chóng)數(shù)量的下降，檢測(cè)同種或異種瘧原蟲(chóng)的重復(fù)感染及瘧疾復(fù)燃情況，同時(shí)由于死亡的瘧疾不能分泌LDH[8-9]，因此能夠考核治療效果和鑒定抗藥株的出現(xiàn)。但由于是定性實(shí)驗(yàn)，不能作為停藥的依據(jù)。

定量PCR的優(yōu)勢(shì)在于解決了對(duì)瘧原蟲(chóng)密度的快速簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的獲取，量化相同蟲(chóng)種不同基因型混合感染的情況，動(dòng)態(tài)觀察疾病發(fā)展?fàn)顩r。從表1中可知，隨著治療天數(shù)的增加，患者DNA拷貝數(shù)逐漸減少，兩周后PCR法轉(zhuǎn)陰，可作為停藥的依據(jù)。

本研究表明，OptiMAL法和PCR法作為鏡檢法的補(bǔ)充，OptiMAL法中LDPH具有很好的特異性，在瘧疾得到治療后，其PLDH能快速?gòu)难褐星宄瑥亩苊庖蜓h(huán)抗原長(zhǎng)期存在所造成的假陽(yáng)性而導(dǎo)致濫用藥物，考核治療效果，更適應(yīng)大規(guī)模流行區(qū)域的需要，PCR法在低原蟲(chóng)血癥、蟲(chóng)體的鑒別和是否繼續(xù)用藥方面具有非常重要的實(shí)用價(jià)值。

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