孫德弢 杜開(kāi)齊 朱有才

武警浙江省總隊(duì)醫(yī)院胸心外科，浙江 嘉興 314000

約70%的非小細(xì)胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）患者在確診時(shí)已處于晚期。研究發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變的NSCLC對(duì)靶向藥物的敏感性大為提高[1]。對(duì)具有EGFR突變的NSCLC患者，吉非替尼比起化療，死亡風(fēng)險(xiǎn)降低了52%，而厄洛替尼也可使50%的具有EGFR突變晚期NSCLC患者生存2年以上。但臨床上由于部分患者獲取病理標(biāo)本有難度，所以傳統(tǒng)EGFR突變檢測(cè)方法具有局限性。外周血取材方便，通過(guò)血清檢測(cè)EGFR突變，如能達(dá)到與組織檢測(cè)相近的結(jié)果，那么則更有臨床實(shí)際意義。2008年1月～2012年3月筆者應(yīng)用高分辨溶解曲線分析 （high-resolution melting analysis，HRM）技術(shù)，探討檢測(cè)外周血EGFR突變與晚期NSCLC一線口服吉非替尼治療的療效之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本組64例患者，其中男21例，女43例，年齡42～76歲，平均61.3歲。所有患者均為初治，經(jīng)胸腹部CT、頭顱核磁共振、全身骨ECT等檢查，確定臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者。病理學(xué)分型：鱗癌12例，腺癌49例，非小細(xì)胞低分化癌3例。

1.2 方法

1.2.1 血漿循環(huán)DNA提取與HRM檢測(cè) 經(jīng)前臂靜脈采集外周血液5 mL，置潔凈抗凝離心管，4℃離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，于4℃下離心10 min，分裝后置-80℃冰箱中保存。解凍后，按高通量血液DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取DNA，溶于50 μL滅菌水中。經(jīng)微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度及含量，提取的DNA放置-20℃冰箱儲(chǔ)存。設(shè)計(jì)上下游引物。PCR反應(yīng)條件為96℃ 2 min，96℃5 s，60℃ 5 s，72℃ 25 s，45 個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增完后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM 分析。HRM 分析條件：95℃ 5 min，40℃ 2 min，60℃1 min，然后以0.1℃/s的速度從65℃升溫至95℃收集溶解曲線數(shù)據(jù)，進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 治療方法 對(duì)檢測(cè)出存在EGFR基因突變的患者（A組）口服吉非替尼250 mg/d，服藥時(shí)間最短2個(gè)月，最長(zhǎng)32個(gè)月。對(duì)檢測(cè)不存在EGFR基因突變的患者（B組）給予多烯紫杉醇加順鉑化療，療程4～6個(gè)。在初始治療期間不采用其他的抗腫瘤治療，直到腫瘤進(jìn)展或患者不能耐受藥物不良反應(yīng)而終止治療。對(duì)于腦轉(zhuǎn)移及孤立的骨轉(zhuǎn)移灶行放療。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

療效分為完全緩解（complete remission，CR）、部分緩解（partial remission，PR）、穩(wěn)定（stable disease，SD）和進(jìn)展（progressive disease，PD），CR和PR要在距離首次評(píng)價(jià)至少 4周后再次確認(rèn)，計(jì)算有效率（response rate，RR）和疾病控制率（disease control rate，DCR）。定期復(fù)查胸腹部CT、頭顱增強(qiáng)MRI及全身同位素骨掃描，進(jìn)行療效判定。無(wú)進(jìn)展生存期（Progressive-free survival，PFS）為患者開(kāi)始治療直至PD的時(shí)間。 RR=（CR+PR）/總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法分析兩組患者的生存率差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

64例患者中，有24例（37.5%）可檢測(cè)出外周血EGFR突變，5例患者因各種原因未進(jìn)行吉非替尼治療，其余19例患者治療后CR+PR為13例，RR為68.4%，DCR為73.7%，中位PFS為12.0個(gè)月；在未檢出突變的40例患者中，8例患者因各種原因未進(jìn)行化療，其余32例患者化療后CR+PR為12例，RR為37.5%，DCR為43.8%，中位PFS為7.3個(gè)月。A組的RR與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=4.561，P=0.033），A組的 DCR與 B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=4.314，P=0.038）。 經(jīng) log-rank 檢驗(yàn)，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，A組的生存率高于 B組 （圖 1）（χ2=7.406，P=0.006）。

圖1 兩組PFS的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

2008年被美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)列為肺癌主要進(jìn)展的血清檢測(cè)EGFR突變研究，成功拓展了組織取材范圍，使得EGFR檢測(cè)的臨床實(shí)用性更強(qiáng)。本研究所采用的HRM檢測(cè)技術(shù)原理是在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行變性，期間實(shí)時(shí)檢測(cè)體系內(nèi)熒光信號(hào)。熒光值隨著溫度變化，可繪制溶解曲線。每一段DNA都有其獨(dú)特的序列，因而也就有了獨(dú)特的溶解曲線形狀，如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。國(guó)內(nèi)學(xué)者[2-3]應(yīng)用HRM法檢測(cè)肺癌患者血漿EGFR基因突變，經(jīng)基因測(cè)序法驗(yàn)證，結(jié)果具有高度相關(guān)性。本組中有24例（37.5%）可檢測(cè)出外周血EGFR突變，可能與腺癌、女性比例較高有關(guān)。

肺癌傳統(tǒng)的化療由于缺乏特異性，取得療效的同時(shí)也往往給患者帶來(lái)較大的毒副作用，其有效率僅為30%～40%。因此，選擇肺癌細(xì)胞特異的分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療，在取得明顯療效的同時(shí)，又可以避免對(duì)正常細(xì)胞的損害。晚期NSCLC的個(gè)體化治療將成為肺癌臨床治療的新模式。Wu等[4]研究表明EGFR突變亞組吉非替尼的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間明顯優(yōu)于紫杉醇加卡鉑。Sirera等[5]的研究中對(duì)EGFR敏感突變（19和21外顯子突變）的患者，均給予厄洛替尼治療，總體生存率較化療延長(zhǎng)了2～3倍，客觀有效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)化療。本研究結(jié)果也表明A組的RR和DCR與B組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，A組的生存率高于B組（P<0.05）。檢測(cè)EGFR基因突變對(duì)于實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療具有重要意義，對(duì)EGFR突變狀態(tài)不明的患者盲目使用這類(lèi)靶向藥物，會(huì)增加EGFR野生型患者的疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。一線靶向藥物選擇的關(guān)鍵是如何更準(zhǔn)確、方便、有效地篩選出EGFR突變患者，這是一線靶向治療獲益的基本保證。然而，臨床上晚期患者病理標(biāo)本獲取率較低，制約了一線靶向治療的應(yīng)用。周小昀等[6]認(rèn)為外周血EGFR突變檢測(cè)結(jié)果與臨床評(píng)估分子靶向治療療效較為符合。本研究結(jié)果也表明對(duì)不能夠獲得足夠病理標(biāo)本的患者通過(guò)血清檢測(cè)EGFR突變狀態(tài)，在治療上具有一定的指導(dǎo)意義。

[1]Paez JG，Janne PA，Lee JC，et al.EGFR mutations in lung cancer：correlation with clinical response to gefitinib therapy [J].Science，2004，304（5676）：1497-1500.

[2]高菲，師建國(guó)，魏金花，等.HRM法檢測(cè)肺癌EGFR基因突變[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011，19（6）：1089-1092.

[3]趙瑾，彭群新，楊炳華，等.應(yīng)用HRM法檢測(cè)肺癌患者循環(huán)DNA中表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2011，19（10）：674-678.

[4]Wu YL，Chu DT，Han B，et al.Phase Ⅲ，randomized，open-label，firstline study in Asia of gefitinib versus carboplatin/paclitaxel in clinically selected patients with advanced non-small-cell lung cancer：evaluation of patients recruited from mainland China [J].Asia Pac J Clin Oncol，2012，8（3）：232-243.

[5]Sirera R，Gil M，Blasco A，et al.Retrospective analysis of the prognostic role of p16 protein inactivation in plasma in patients with locally advanced non-small cell lung cancer [J].Lung Cancer，2008 ，61（1）：104-108.

[6]周小昀，李龍蕓，崔巍，等.檢測(cè)肺癌患者血清游離DNA的EGFR基因點(diǎn)突變與 EGFR-TKI療效的相關(guān)性分析[J].癌癥進(jìn)展，2011，9（1）：13-18.