方 慶 朱慶豐 尹國才 陳新生

1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽 安慶 246003；2.安慶師范學(xué)院生命科學(xué)系，安徽 安慶 246003

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多疾病都存在不同程度和方式的神經(jīng)細(xì)胞缺失或變性死亡，并由此引起神經(jīng)功能的損害。傳統(tǒng)的治療效果多不顯著，神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的發(fā)現(xiàn)與移植研究為其治療帶來了新的思路和方法。本研究旨在探索人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)條件，從而在體外大量增殖神經(jīng)干細(xì)胞，并觀察神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

水囊引產(chǎn)的14周妊娠胎兒1例，由臨床科室提供，孕婦自愿捐獻(xiàn)，對(duì)其使用遵守醫(yī)學(xué)倫理原則并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

DMEM/F12（1：1）培養(yǎng)基、B27、N2、堿性成纖維生長因子（bFGF）（Gibco 公司）、 表皮生長因子 （EGF）（Invitrogen 公司）、鼠抗人巢蛋白（Nestin）單克隆抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（Bdbioscience公司）、鼠抗人神經(jīng)特異烯醇化酶（NSE）單克隆抗體、鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體（Neomarkers公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取材及原代細(xì)胞培養(yǎng) 取14周水囊引產(chǎn)的人胚胎，無菌條件下取海馬組織，用D-Hanks液漂洗，剪成1 mm3大小的組織塊，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化15 min，用200目不銹鋼細(xì)胞篩，去除大塊組織，離心后收集沉淀細(xì)胞，將其重懸于含B27（1∶50）、N2（1∶100）、EGF（20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)液中。記數(shù)細(xì)胞活力后，按2×105/mL接種密度于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2靜置培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的生長狀況，3 d半量換液1次。

1.3.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 傳代時(shí)，將神經(jīng)細(xì)胞球收集于離心管經(jīng)0.125%胰酶2 min，1000 r/min離心5 min后加入新鮮的全培養(yǎng)基，用移液器吹打10～15次，計(jì)數(shù)并以2×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4 d換半液1次，7～10 d傳代1次，方法同前。

1.3.3 神經(jīng)球細(xì)胞爬片的制備及誘導(dǎo)分化 收集培養(yǎng)3～4代的“神經(jīng)球”，接種于含有10%胎牛血清的24孔培養(yǎng)板中（內(nèi)置經(jīng)多聚賴氨酸涂片的載玻片），37℃、5%CO2，貼壁培養(yǎng)約4 h，取出部分載玻片。將未取出的附著在載玻片上的“神經(jīng)球”誘導(dǎo)分化3～5 d，取出載玻片。取出的載玻片經(jīng)4%多聚甲醛固定后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定 取出3～4代的“神經(jīng)球”細(xì)胞爬片，行Nestin免疫熒光染色鑒定。另將上述經(jīng)10%胎牛血清誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞爬片行NSE、GFAP免疫熒光單標(biāo)染色，同時(shí)做陰性對(duì)照。室溫下，正常山羊血清作用阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)，濕盒下孵育一抗和熒光二抗，熒光倒置顯微鏡下觀察和記錄照相。

2 結(jié)果

2.1 原代、傳代活細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

初分離的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，為圓形亮球狀，周圍有清晰的光暈，內(nèi)部背景清晰；經(jīng)錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞在95%以上。2～3 d后，分裂形成多個(gè)細(xì)胞組成的懸浮生長細(xì)胞團(tuán)，形狀不規(guī)則，大小不一，細(xì)胞之間結(jié)合較為松散（圖1）。6～7 d后，可見達(dá)數(shù)十個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)，呈球形或卵圓形，鏡下細(xì)胞團(tuán)周邊細(xì)胞較亮，中心區(qū)細(xì)胞密度高，透光性差，有細(xì)胞溶解死亡現(xiàn)象（圖2），此時(shí)需及時(shí)傳代。在傳代過程中，第2～6代的神經(jīng)干細(xì)胞生長迅速。形成的神經(jīng)球內(nèi)細(xì)胞結(jié)合相當(dāng)緊密，不易分開（圖3）。

圖1 原代培養(yǎng)3 d的細(xì)胞團(tuán)（×200）

圖2 原代培養(yǎng)6 d的細(xì)胞團(tuán)（×200）

圖3 第3代的神經(jīng)干細(xì)胞球（×200）

圖4 誘導(dǎo)分化5 d后，神經(jīng)元樣細(xì)胞（×100）

圖5 誘導(dǎo)分化后5 d，星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞（錐蟲藍(lán)×100）

2.2 誘導(dǎo)分化的活細(xì)胞觀察

神經(jīng)球3～4 h后很快貼壁，培養(yǎng)24 h后可見單個(gè)細(xì)胞從“神經(jīng)球”內(nèi)爬出。2 d后突起不斷增粗和伸長，形態(tài)不規(guī)則，與周圍細(xì)胞互相聯(lián)接。5 d后分化出細(xì)胞逐漸增多，形成較大的冠面，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)主要分為三種類型：①神經(jīng)元樣細(xì)胞（圖4）；②星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞（圖5）；③少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞標(biāo)志物的鑒定

3～4代后，細(xì)胞球中大多數(shù)細(xì)胞免疫熒光染色呈陽性反應(yīng)，表達(dá)NSC的特征性標(biāo)志抗原Nestin（圖6）。10%胎牛血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)后NSE或GFAP免疫熒光染色結(jié)果顯示部分細(xì)胞胞漿呈綠色熒光，即為NSE和GFAP陽性表達(dá)（圖7、8）。

圖6 神經(jīng)球Nestin免疫熒光染色陽性（×200）

圖7 誘導(dǎo)分化5 d后，免疫熒光染色呈NSE陽性的神經(jīng)元（×400）

圖8 誘導(dǎo)分化5 d后，免疫熒光染色呈GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞（×400）

3 討論

原代取材是進(jìn)行組織培養(yǎng)的第一步。比較從胚胎期、新生兒期、嬰幼兒期及成年期尸體分離培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，胚胎期分離的神經(jīng)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力[1-3]，并且成體神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)的傳代能力有限，長期體外培養(yǎng)也不能產(chǎn)生足夠數(shù)量的神經(jīng)元[4]。在人胎腦的研究方面，國內(nèi)學(xué)者通過研究同一胎齡不同部位來源的神經(jīng)干細(xì)胞，得出以下結(jié)論：在人胎腦的海馬、室下區(qū)、紋狀體、額葉、顳葉、頂葉、枕葉7個(gè)部位均存在神經(jīng)干細(xì)胞且數(shù)量依次逐漸減少[5-6]。在本研究中，筆者取材于14周人胎腦海馬區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)目明顯增多，且能夠在體外培養(yǎng)條件下連續(xù)分裂增殖。

生長因子在無血清培養(yǎng)基中對(duì)于維持神經(jīng)干細(xì)胞生長與增殖是不可或缺的[7-8]。bFGF和EGF是在神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)研究中用于其培養(yǎng)最多見的兩種神經(jīng)生長因子[9]。它們主要是作為神經(jīng)干細(xì)胞有絲分裂中的分裂原而產(chǎn)生作用的，大量研究證明，EGF主要是在體外培養(yǎng)的早期為神經(jīng)干細(xì)胞所需，bFGF主要是在神經(jīng)干細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮作用，它們共同作用以維持神經(jīng)干細(xì)胞體外有絲分裂以及增殖[10-12]。

傳代操作對(duì)于培養(yǎng)的成功與否是至關(guān)重要的。文獻(xiàn)報(bào)道中主要包括機(jī)械分離和胰酶消化兩種。研究證實(shí)，單純吸管吹打無論從分離細(xì)胞的數(shù)量或存活率方面均不及酶消化結(jié)合吸管吹打的方法，這主要由于吸管吹打的機(jī)械切割作用使細(xì)胞活性受到一定影響且不利于分離組織內(nèi)的細(xì)胞[13]。培養(yǎng)過程中，一般以神經(jīng)球的大小作為判斷傳代時(shí)機(jī)的標(biāo)志，筆者的經(jīng)驗(yàn)是神經(jīng)球的直徑在0.6～0.8 mm時(shí)進(jìn)行傳代是最適合的，神經(jīng)球過大或過小都對(duì)傳代后神經(jīng)干細(xì)胞的活性造成損害[14]。

神經(jīng)干細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定標(biāo)記物中最常用的為Nestin。該蛋白只在多潛能的神經(jīng)外胚層細(xì)胞表達(dá)，隨著神經(jīng)上皮的分化成熟逐漸消失，其功能現(xiàn)在尚未完全明確，可能具有機(jī)構(gòu)和信息傳遞的功能。神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定，還應(yīng)看是否能分化成神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及是否能分裂增殖。本研究中筆者分別用Nestin單抗標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞，用NSE單抗標(biāo)記神經(jīng)元，用GFAP單抗標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，利用免疫熒光技術(shù)觀察到了綠色熒光，證明從人胎腦海馬獲得了NSCs，且其具有自我更新能力和多向分化的潛能，為進(jìn)一步用于基礎(chǔ)及臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

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