顧永偉 王 晞 黨 松 胡 娟 王 鑫 熊 亮 朱 丹

武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430060

心肌梗死后會誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，炎癥介質(zhì)會促進(jìn)心室重構(gòu)的發(fā)生，主要表現(xiàn)為心肌纖維化，纖維化直接導(dǎo)致心臟舒張功能減弱，從而進(jìn)展為心力衰竭[1-2]。

青蒿素是一種菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種具有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有抗瘧疾、抗增殖、抗纖維化、抗心肌肥大的作用[3-4]。但是，青蒿素對心肌梗死后纖維化的影響及其機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察青蒿素對大鼠心肌梗死后心功能的影響以及對心肌纖維化相關(guān)因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ）表達(dá)的影響，從而探討青蒿素對心肌梗死后心肌纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制作

成年SD雄性大鼠，體重200～250 g（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心提供）。大鼠采用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后將大鼠固定在手術(shù)臺，剪開頸部皮膚分離氣管，行氣管插管，同時(shí)將氣管插管針與小動物呼吸機(jī)連接。切開胸部皮膚分離胸大肌，剪開第2根肋骨，將心臟暴露，在肺動脈圓錐和左心耳之間結(jié)扎冠狀動脈。結(jié)扎成功后缺血區(qū)心肌組織變白，同時(shí)心電圖對應(yīng)的導(dǎo)聯(lián)抬高。假手術(shù)組只進(jìn)行開胸和分離冠狀動脈但是不結(jié)扎。術(shù)后24 h將心肌梗死模型制備成功的大鼠隨機(jī)分為對照組和青蒿素組。青蒿素組按照75 mg/(kg·d)劑量灌胃，每日3次。對照組和假手術(shù)組灌胃等量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，治療4周后檢測心功能和纖維化相關(guān)指標(biāo)。

1.2 超聲心動圖和血流動力學(xué)檢測

心肌梗死后4周利用超聲心動圖檢測心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化。超聲檢查前，每只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，然后檢測乳頭肌水平胸骨旁短軸切面，分別測量左心室舒張末期內(nèi)徑 （left ventricle end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricle end systolic dimension，LVESD）、左心室射血分?jǐn)?shù)（eject fraction，EF）以及左心室短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）。血流動力學(xué)檢測時(shí)，將微導(dǎo)管從大鼠右頸總動脈插入左心室，同時(shí)記錄左心室收縮末壓 （left ventricular end-systolic pressure，LVESP）和左心室舒張末壓（left ventricle end-diastolic pressure，LVEDP）以及壓力上升最大速率（dp/dtmax）。

1.3 免疫組織化學(xué)分析心肌梗死面積和心肌纖維化

心肌梗死后4周，取出大鼠心臟放入10%濃度的福爾馬林溶液中固定，取左心室長軸以下部分石蠟包埋，切取4 μm厚的截面標(biāo)本行Mallory-Azan染色，用圖像分析軟件測定梗死面積并取均值。Mallory-Azan染色切片用來定量測定血管周圍心肌纖維化面積，每個心臟取10個視野然后取其平均值。

1.4 Western blot檢測TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表達(dá)

分別取梗死邊緣區(qū)和假手術(shù)組對應(yīng)區(qū)心肌組織提取蛋白。各取等量的蛋白樣品，加入10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后通過電轉(zhuǎn)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，將膜置入10%脫脂奶粉中室溫封閉20 min，再加入1∶1000稀釋的一抗（TGF-β1兔抗鼠和collagen typeⅠ兔抗鼠），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入1∶20的二抗37℃孵育1 h，然后再用TBST洗膜3次。將膜同ECL反應(yīng)，1～5 min后曝光于X光膠片上。通過光密度軟件分析，將目的條帶值與β-actin值比較，相對值為TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物生存率和心肌梗死面積比較

心肌梗死后4周，假手術(shù)組生存率顯著高于對照組和青蒿素組；與對照組比較，青蒿素組生存率顯著提高（65%vs 40%，P＜0.05）；對照組與青蒿素組大鼠心肌梗死面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（41.00±4.40）%vs （38.38±4.36）%，P ＞ 0.05]。

2.2 超聲心動圖和血流動力學(xué)檢查結(jié)果

心肌梗死后4周，對照組和青蒿素組LVEDP、LVESD、LVEDD與假手術(shù)組比較顯著增加，而FS和dP/dtmax則顯著降低，表明心肌梗死模型制備成功。青蒿素治療組與對照組比較，LVEDP、LVESD、LVEDD 顯著縮小，而 FS 和 dP/dtmax顯著增加（P<0.05）。 見表 1。

2.3 梗死周邊區(qū)心肌纖維化變化情況

梗死周邊區(qū)心肌纖維化導(dǎo)致心肌僵硬舒張功能減弱，惡化心功能。本研究通過對組織切片行Mallory-Azan染色，然后定量分析，發(fā)現(xiàn)青蒿素治療組和對照組的血管周圍纖維化范圍與假手術(shù)組比較顯著增加（P<0.05），但是青蒿素治療組與對照組比較顯著減輕（P<0.05）。見圖1。

2.4 梗死周邊區(qū)心肌組織TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表達(dá)情況

心肌梗死后4周發(fā)現(xiàn)，對照組和青蒿素組TGF-β1蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較顯著增高（P<0.05），而青蒿素組TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組（P<0.05）。見圖2。

表1 超聲心動圖和血流動力學(xué)檢測（）

表1 超聲心動圖和血流動力學(xué)檢測（）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與對照組比較，&P＜0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

圖1 心肌梗死后4周，血管周圍纖維化面積定量分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素具有抑制心肌梗死后心室重構(gòu)改善心功能提高生存率的作用。青蒿素對心肌梗死后心臟的保護(hù)作用主要通過抑制心肌梗死后的炎癥因子的表達(dá)、心肌纖維化的進(jìn)程，從而緩減心室重構(gòu)。

心肌梗死后伴有心室重構(gòu)的發(fā)生，其中包括左室腔的擴(kuò)大和功能的改變。心室重構(gòu)是一個慢性進(jìn)展性過程，其中包括非梗死區(qū)心肌細(xì)胞的肥大、細(xì)胞外基質(zhì)合成增加、心肌間質(zhì)纖維化程度的加劇，最終導(dǎo)致心室腔的擴(kuò)大[5]。這種病理性重構(gòu)導(dǎo)致心臟功能障礙，已成為心肌梗死后患者致殘和致死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。本實(shí)驗(yàn)筆者通過建立大鼠心肌梗死模型觀察青蒿素對大鼠心肌梗死后心功能以及生存率的影響。青蒿素治療4周后筆者發(fā)現(xiàn)，青蒿素組與對照組比較生存率和心功能顯著增加（P<0.05），心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)得到顯著緩減。研究結(jié)果表明，青蒿素具有潛在抑制心肌梗死后心室重構(gòu)的作用。

圖2 Western blot分析梗死周邊區(qū)心肌組織TGF-β1及collagen typeⅠ的表達(dá)水平

心肌梗死后壞死的細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生大量的炎癥因子，這些炎癥因子促進(jìn)心肌纖維化，加劇心室重構(gòu)。NF-κB是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[7]。心肌梗死后NF-κB信號通路被激活，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，釋放大量炎癥因子，如TGF-β1。TGF-β1在心肌纖維化的過程中起著重要的作用，它可以調(diào)控成纖維細(xì)胞分化為肌纖維母細(xì)胞，肌纖維母細(xì)胞促進(jìn)膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，導(dǎo)致心肌纖維化程度加重，心肌僵硬度增加，心室舒張功能障礙[8]。本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素可以顯著減輕心肌間質(zhì)纖維化，同時(shí)也減少TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白的表達(dá)，表明青蒿素通過下調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá)，減少心肌纖維化，改善心臟功能。

總之，青蒿素可以抑制心肌梗死后心室重構(gòu)，增強(qiáng)心功能。青蒿素的心臟保護(hù)作用可能是通過下調(diào)TGF-β1蛋白的表達(dá)，減少心肌纖維化實(shí)現(xiàn)的。

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