胡曦予，崔 勵，馮 魁

(大連工業(yè)大學輕工與化學工程學院，遼寧 大連 116034)

甾體類藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，隨著需求量的不斷增大，其合成技術也得到了越來越廣泛和深入的研究[1]。甾體類藥物的傳統(tǒng)化學合成方法步驟繁瑣、副產品多、產率低且環(huán)境污染嚴重，而微生物轉化技術具有專一性強、產率高、條件溫和、污染少等諸多優(yōu)點，而且其轉化反應類型十分豐富[2]，因此越來越受到重視。

雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androst-4-ene-3,17-dione，AD)是制造甾體激素類藥物的關鍵中間體，常用于制備孕激素、雄激素、皮質激素、避孕藥等[3]，在甾體母核引入羥基，可使其抗炎活性大大增強。其11α-羥基化獲得的11α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮是制備治療高血壓及充血性心力衰竭的新型藥物的關鍵中間體，且臨床療效優(yōu)于其它同類藥物[4]。

作者采用微生物轉化法，以黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-M246催化底物雄甾-4-烯-3，17-二酮進行11α-羥基化反應，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基，以使其有利于菌體生長及轉化，擬為11α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮的工業(yè)化生產奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌株與試劑

黑根霉RN-M246，清華大學生命科學院。

雄甾-4-烯-3,17-二酮，Sigma公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：小米培養(yǎng)基，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖30，玉米漿20，蠶蛹粉10，硫酸銨1，磷酸氫二鉀5，pH值5.0。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

黑根霉斜面中加適量無菌水，將孢子洗下，紗布過濾，充分振蕩，制成1×107～1×108個·mL-1孢子懸液。

1.3.2 搖瓶轉化

在500 mL擋板搖瓶中加入75 mL發(fā)酵培養(yǎng)基和10 mmol·L-1的底物，滅菌后超聲，接入4%的菌懸液，在28 ℃、160 r·min-1條件下轉化24 h，其后提高轉速至220 r·min-1繼續(xù)轉化48 h。

1.3.3 HPLC分析

將發(fā)酵液高速離心，取上清液用甲醇稀釋，稀釋液經0.45 μm有機濾膜過濾，作為檢測樣品，進行HPLC分析。色譜條件：C18烷基硅烷鍵合反相柱；流動相為甲醇-水(3∶2，體積比)；流速0.8 mL·min-1；色譜柱溫25 ℃；紫外檢測器波長242 nm。

2 結果與討論

2.1 碳源對轉化反應的影響

碳源是培養(yǎng)基組成的重要成分之一，是菌體生長所需的重要營養(yǎng)物質，同時也影響著轉化反應過程。固定發(fā)酵培養(yǎng)基中其它組分不變，分別考察不同碳源(30 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、麥芽浸粉、可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精、糖蜜)對轉化率的影響，結果見圖1。

圖1 不同碳源對轉化率的影響

由圖1可知，葡萄糖與糊精作為培養(yǎng)基碳源時的轉化率較高。其中，葡萄糖較易被微生物利用并轉化成菌體生長所需的能量和碳成分，且價廉易得，廣泛應用于微生物實驗和工業(yè)化生產。因此，選用葡萄糖為最佳碳源。

2.2 速效有機氮源對轉化反應的影響

速效有機氮源中豐富的營養(yǎng)物質能夠快速而直接地被菌體吸收利用，使得菌體能在較短時間內生長，增加菌絲濃度。碳源為葡萄糖，固定發(fā)酵培養(yǎng)基中其它組分不變，分別考察不同速效有機氮源(20 g·L-1的蛋白胨、玉米漿、酵母浸粉、酵母浸膏、牛肉浸膏)對轉化率的影響，結果見圖2。

圖2 不同速效有機氮源對轉化率的影響

由圖2可知，蛋白胨為速效有機氮源時的轉化率最高，較原培養(yǎng)基中的玉米漿提高了8%。因此，選擇蛋白胨為最佳速效有機氮源。

2.3 遲效氮源對轉化反應的影響

黑根霉轉化AD實驗采用一步轉化法，其發(fā)酵周期較長，在培養(yǎng)基中加入遲效氮源利于發(fā)酵后期營養(yǎng)物質的供給及代謝產物的形成。碳源為葡萄糖、速效有機氮源為蛋白胨，固定發(fā)酵培養(yǎng)基其它組分不變，考察不同遲效氮源(10 g·L-1的蠶蛹粉、冷榨豆粉、熱榨豆粉、麩質粉、玉米蛋白粉)對轉化率的影響，結果見圖3。

圖3 不同遲效氮源對轉化率的影響

由圖3可知，冷榨豆粉作為遲效氮源時的轉化率最高，相對于原培養(yǎng)基轉化率提高了5%。因此，選用冷榨豆粉為最佳遲效氮源。

2.4 無機氮源對轉化反應的影響

碳源為葡萄糖、速效有機氮源為蛋白胨、遲效氮源為冷榨豆粉，固定發(fā)酵培養(yǎng)基其它組分不變，考察不同無機氮源(1 g·L-1的乙酸銨、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、檸檬酸三銨)對轉化率的影響，結果見圖4。

圖4 不同無機氮源對轉化率的影響

由圖4可知，硫酸銨和檸檬酸三銨有助于轉化率的提高。其中，添加硫酸銨的培養(yǎng)基所生長的菌體較易成團，導致轉化率下降，而添加檸檬酸三銨的培養(yǎng)基所生長的菌體分散均勻，在較快的轉速下仍不成團，保證了轉化過程的順利進行，其原因是檸檬酸三銨不僅提供了氮源，還起到了穩(wěn)定和分散的作用。因此，選用檸檬酸三銨為最佳無機氮源。

2.5 pH值對轉化反應的影響

pH值是影響菌體生長及轉化過程的重要因素之一，不僅影響菌體的生長，同時也影響酶活性。在上述優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，考察發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值對轉化率的影響，結果見圖5。

圖5 pH值對轉化率的影響

由圖5可知，發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為5.0時的轉化率最高，達到48.4%，較原培養(yǎng)基轉化率提高了約13%。因此，選用發(fā)酵最佳pH值為5.0。

3 結論

采用微生物轉化法，以黑根霉RN-M246催化雄甾-4-烯-3,17-二酮11α-羥基化反應，考察了發(fā)酵培養(yǎng)基對轉化率的影響。研究發(fā)現(xiàn)：常用作分散劑的檸檬酸三銨是菌體形態(tài)的主要影響因素，有效地改善了菌體易成團的現(xiàn)象，且菌量適中，均勻分散；蛋白胨含有較豐富的氨基酸等營養(yǎng)物質，作為速效有機氮源更有利于菌體在前期成長；而黑根霉的生長及轉化時間較長，添加遲效氮源冷榨豆粉能夠保證發(fā)酵后期營養(yǎng)的供給，使菌絲體持續(xù)生長并進行轉化反應。

確定優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)為：葡萄糖30、蛋白胨20、冷榨豆粉10、檸檬酸三銨1、磷酸氫二鉀5、pH值5.0，在此條件下，可提高轉化率約13%，最終轉化率達48.4%。

[1] 郭一平，鄭璞.甾體微生物C11α-羥化反應的研究進展[J].浙江工業(yè)大學學報，2004，32(4):437-441.

[2] 張麗青.微生物轉化在甾體藥物合成中的應用[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1985,18(1):27-41.

[3] 楊英，姜紹通.微生物降解甾醇側鏈轉化雄甾-4-烯-3,17-二酮的研究進展[J].微生物學通報，2006,33(6)：142-145.

[4] Davis K L,Nappi J M.The cardiovascular effects of eplerenone,a selective aldosterone-receptor antagonist[J].Clinical Therapeutics，2003,25(11):2647-2668.