孫 群，李步海

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 國(guó)家民委分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430074)

從生物樣品中提取核酸是分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的一項(xiàng)基本技術(shù)。核酸提取的傳統(tǒng)方法有PEG沉淀法、CsCl超速離心法、離子交換樹(shù)脂法、煮沸裂解法和堿裂解法等[1]。這些方法往往耗時(shí)長(zhǎng)、使用有毒的試劑且提取的DNA純度不高。人們期望研發(fā)一種簡(jiǎn)易高效的質(zhì)粒DNA提取方法。其中,用表面修飾的磁性粒子作為載體,利用磁性材料在外磁場(chǎng)下易于相分離的特點(diǎn)，可望成為一種有潛力的方法。磁性微粒作為一種新型的基質(zhì),可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化和加速核酸的分離與純化過(guò)程，實(shí)現(xiàn)核酸純化處理的微型化、自動(dòng)化和平行化[2,3]。

各種修飾磁性微粒的應(yīng)用發(fā)展迅速，比如在磁性微粒表面連接NTA-Ni2+分離蛋白質(zhì)、核酸等，或者在表面連接膦酸[4,5]，利用其易修飾性、特殊化學(xué)特點(diǎn)和物理惰性，保護(hù)內(nèi)部結(jié)構(gòu)并避免外部環(huán)境的干擾[6]，而在磁性微球表面連接雙甘膦(PMIDA)可以有效減少磁場(chǎng)條件下的結(jié)塊，從而增加羧基的數(shù)量[7]，更有利于連接金屬離子，達(dá)到吸附核酸的目的。該方法簡(jiǎn)便快速，吸附分離效果好，有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。作者在此用雙甘膦修飾磁性四氧化三鐵納米微球(MNP)并負(fù)載Zn2+后用于提取DNA，并考察了相關(guān)因素的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

小牛胸腺DNA，Sigma-Aldrich試劑公司；雙甘膦(PMIDA)，阿拉丁試劑公司；FeCl2·4 H2O，廣東臺(tái)山眾城化工有限公司；濃氨水；FeCl3·6H2O，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ZnSO4·7H2O，杭州蕭山化學(xué)試劑廠。所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

UV2300Ⅱ型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；SHZ-03型恒溫水浴搖床，上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Gene Genius & Gene Gnome型Gene Genius成像系統(tǒng)，Synoptics Ltd.；PAC3000型超聲儀。

1.2 方法

1.2.1 DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將小牛胸腺 DNA溶于 10 mL 10% NaCl溶液中得到濃度為 1.461 g·L-1的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液(經(jīng)紫外光譜測(cè)定260 nm處吸收值后，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式cDNA=50A260計(jì)算溶液DNA濃度)。

1.2.2 磁性四氧化三鐵納米微球的制備

稱(chēng)取FeCl2·4 H2O 2.17 g、 FeCl3·6H2O 5.26 g,溶于100 mL去離子水中，在N2氛圍下加熱至60 ℃，攪拌下緩慢滴加12 mL濃氨水，持續(xù)反應(yīng)1 h，冷卻至室溫,磁場(chǎng)分離。用去離子水洗3～4次，60 ℃真空干燥4 h，得到磁性四氧化三鐵納米微球(MNP)。

1.2.3 PMIDA-Zn2+修飾磁性微球的制備

(1)PMIDA修飾磁性微球：稱(chēng)取0.232 g(1 mmol)MNP于去離子水中超聲分散20 min，再加入3.5 mmol的PMIDA,在室溫下反應(yīng)12 h，并用1.25 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為10。反應(yīng)結(jié)束后磁場(chǎng)分離，用去離子水洗3～4次，洗滌液與上清液合并，用于測(cè)定磁性微球已修飾PMIDA的量；固體在60 ℃下真空干燥4 h，即得PMIDA修飾磁性微球。

(2) PMIDA-Zn2+修飾磁性微球：向0.1 g PMIDA修飾磁性微球中加入0.1 mol·L-1的ZnSO4·7H2O 溶液15 mL，常溫下振蕩。反應(yīng)結(jié)束后磁場(chǎng)分離，用去離子水洗至上清液無(wú)Zn2+，60 ℃真空干燥4 h，即得PMIDA-Zn2+修飾磁性微球。

1.2.4 磁性微球已修飾PMIDA的量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[8]，用濃硫酸消解法測(cè)定反應(yīng)后上清液及洗滌液中剩余PMIDA的量。磁性微球已修飾PMIDA的量=修飾前加入PMIDA的量-修飾后上清液及洗滌液中剩余PMIDA的量。

1.2.5 吸附與洗脫實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 吸附

分別稱(chēng)取10 mg吸附劑(PMIDA-Zn2+修飾磁性微球)于離心管中,各加入濃度為1.461 g·L-1的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL和不同pH值的緩沖溶液 1.0 mL,渦旋混勻，室溫下溫和振搖20 min，磁場(chǎng)分離，吸出上層清液0.85 mL并用去離子水稀釋4倍 ,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定260 nm處的吸光度。

1.2.5.2 洗脫

取10 mg已吸附DNA的吸附劑，加入不同濃度的氨水，渦旋混勻后靜置10 min，磁場(chǎng)分離磁性微球,吸取洗脫液用于核酸的紫外測(cè)定。

1.2.6 玉米DNA的提取

玉米基因組的提取方法參考文獻(xiàn)[9] 。具體步驟為：取液氮下研磨過(guò)的玉米1.5 g,加入到含3.0 mL細(xì)胞裂解液( 0.1 mol·L-1Tris-HCl , 0.05 mol·L-1EDTA, 0.5 mol·L-1NaCl，pH值8.0)的10 mL離心管中，再加入10%十二烷基硫酸鈉(SDS)500 μL。65 ℃水浴處理30 min,5000 r·min-1離心,得到1.5 mL細(xì)胞裂解清液。移取0.4 mL裂解清液于10 mg磁性微球中,渦旋5 s。再加入核酸吸附液( 20% PEG-8000，2 mol·L-1NaCl，pH值5.0) 1.0 mL,渦旋混勻,35 ℃振蕩20 min。磁場(chǎng)下分離并棄去上層清液。用80%異丙醇和70%乙醇1.0 mL洗滌磁性微球各2次。吹干乙醇后,加入TE緩沖溶液 (10 mmol·L-1Tris-HCl,1 mmol·L-1EDTA , pH值7.8)200 μL,渦旋混勻，靜置10 min，磁場(chǎng)下分離磁性微球,吸取洗脫液150 μL，向吸附劑中加入TE緩沖溶液200 μL重復(fù)解吸1次，合并洗脫液，稀釋至1 mL，紫外檢測(cè)提取的DNA。吸附劑中剩余的洗脫液進(jìn)行凝膠電泳分離實(shí)驗(yàn)。

電泳條件：取樣品溶液10 μL與1 μL溴酚藍(lán)溶液于TAE緩沖溶液(0.04 mol·L-1Tris-CH3COOH , 0.001 mol·L-1EDTA，pH值8.0)中上樣，10%瓊脂糖凝膠電泳(150 V，30 min)。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性微球已修飾PMIDA的量

測(cè)定結(jié)果表明，磁性微球表面PMIDA的結(jié)合量為546.5 mg·g-1,證明PMIDA已修飾到磁性納米微球上。

2.2 DNA吸附的影響因素

2.2.1 pH值

圖1 pH值對(duì)DNA吸附率的影響

2.2.2 離子強(qiáng)度

圖2 離子強(qiáng)度對(duì)DNA吸附率的影響

固定吸附時(shí)間為20 min、pH值為5.0，其它條件同2.2.1，考察離子強(qiáng)度(NaCl濃度)對(duì)DNA吸附的影響，結(jié)果如圖2所示。 由圖2可知，隨著離子強(qiáng)度的增大，吸附率逐漸升高；但離子強(qiáng)度超過(guò)2.0 mol·L-1后，吸附率基本不變。因此，確定適宜的離子強(qiáng)度為2.0 mol·L-1。

2.2.3 吸附時(shí)間

固定NaCl濃度為2.0 mol·L-1，其它條件同2.2.2，考察吸附時(shí)間對(duì)DNA吸附的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 吸附時(shí)間對(duì)DNA吸附率的影響

由圖3可知，在吸附初期，由于修飾磁性微球上的吸附位點(diǎn)較多，吸附率上升較快；隨著吸附的進(jìn)行，吸附位點(diǎn)變少至達(dá)到平衡；吸附20 min后，吸附率幾乎不變。因此，確定適宜的吸附時(shí)間為20 min。

2.2.4 吸附溫度

固定NaCl濃度為2.0 mol·L-1，其它條件同2.2.2，考察吸附溫度對(duì)DNA吸附的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 吸附溫度對(duì)DNA吸附率的影響

由圖4可知，在0～40 ℃范圍內(nèi)，吸附率隨著吸附溫度的升高而上升。這是因?yàn)椋綔囟壬?，溶液中分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，吸附率上升。考慮到動(dòng)物體內(nèi)DNA存在的環(huán)境，確定適宜的吸附溫度為35 ℃。

2.2.5 吸附劑用量

在吸附劑用量為10 mg、pH值為5.0、NaCl濃度為2.0 mol·L-1、吸附溫度為35 ℃、吸附時(shí)間為20 min的條件下，DNA吸附率可達(dá)80%，且隨著吸附劑用量的增加而上升，當(dāng)吸附劑用量為30 mg時(shí)，吸附率達(dá)到100%。這是因?yàn)?，所用吸附劑越多，?duì)一定濃度DNA的吸附越完全，因此，在實(shí)際使用時(shí)，應(yīng)根據(jù)溶液中DNA濃度選擇適當(dāng)?shù)奈絼┯昧?，以保證吸附完全。

2.2.6 DNA濃度

確定吸附劑用量為10 mg、pH值為5.0、NaCl濃度為2.0 mol·L-1、吸附溫度為35 ℃、吸附時(shí)間為20 min，測(cè)定吸附劑對(duì)不同初始濃度DNA的吸附容量，繪制DNA的吸附等溫線，見(jiàn)圖5。

圖5 DNA的吸附等溫線

由圖5可知，吸附劑對(duì)DNA的吸附容量隨著DNA初始濃度的增大而增大；當(dāng)DNA初始濃度超過(guò)一定值后，DNA吸附容量變化不大。

吸附容量是判斷吸附性能的一個(gè)重要指標(biāo)。分別用Langmuir和Freundlich吸附模型對(duì)吸附等溫線進(jìn)行擬合，Langmuir和Freundlich吸附等溫線模擬圖和模擬參數(shù)分別見(jiàn)圖6、表1。

圖6 DNA的Langmuir吸附等溫線模擬圖(a)和Freundlich吸附等溫線模擬圖(b)

表1 DNA的Langmuir和Freundlich吸附等溫線模擬參數(shù)

由圖6和表1可知，Langmuir模型和Freundlich模型的相關(guān)系數(shù)分別為0.9755和0.9212，表明PMIDA-Zn2+修飾磁性微球?qū)NA的吸附更符合Langmuir吸附模型，其理論最大吸附容量為26.27 mg·g-1，與實(shí)驗(yàn)值21 mg·g-1基本吻合。

2.3 DNA的洗脫

以氨水洗脫被吸附的DNA，氨水濃度對(duì)DNA洗脫的影響見(jiàn)圖7。

圖7 氨水濃度對(duì)DNA洗脫的影響

2.4 吸附劑提取玉米中DNA

以洗脫液A260/A280的比值表示提取后DNA的純度，紫外測(cè)定該比值為1.6382，說(shuō)明提取的DNA純度較高，進(jìn)一步計(jì)算其濃度為333.800 μg·mL-1。

洗脫液對(duì)應(yīng)的10%瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖8所示。圖8中出現(xiàn)較明顯的DNA譜帶，證明DNA已提取并洗脫下來(lái)，且純度較高。

2.5 討論

實(shí)驗(yàn)采用固相吸附的方法,以直接研磨玉米面的方法將玉米細(xì)胞壁打破,之后加入一定量的細(xì)胞提取液,參考文獻(xiàn)[9],向吸附液中加入20%PEG后，在PEG與 NaCl共同作用下將 DNA吸附到磁性微球表面 ,選擇性迅速提高，因?yàn)镈NA的脫水作用是 DNA析出的主要?jiǎng)恿10，11]，用 TE緩沖溶液將 DNA洗脫下來(lái)結(jié)果較理想。

1，2.洗脫液平行2次進(jìn)樣 M.DNA Mark

3 結(jié)論

用雙甘膦(PMIDA)修飾磁性四氧化三鐵納米微球(MNP)并負(fù)載Zn2+后用于提取DNA。當(dāng)吸附劑用量為10 mg、pH值為5.0、離子強(qiáng)度(NaCl濃度)為2.0 mol·L-1、吸附時(shí)間為20 min、吸附溫度為35 ℃時(shí)，DNA吸附率達(dá)80%、吸附容量為21 mg·g-1。在低pH值、高濃度的鹽存在下,DNA的磷酸基團(tuán)與基質(zhì)螯合的Zn2+靜電結(jié)合，能大大提高PMIDA-Zn2+修飾磁性微球?qū)NA的吸附率。在氨水濃度為3.5%時(shí)，DNA能從吸附劑表面完全洗脫下來(lái), 從而達(dá)到分離純化的目的。用制備的吸附劑從玉米中提取DNA,提取純度較高(A260/A280=1.6382)。此方法簡(jiǎn)便快速，所得DNA純度較高，效果令人滿意。

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