黃齊茂，李 清，王司衛(wèi)，潘志權(quán)

(武漢工程大學(xué) 綠色化工過程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430073)

光動力療法(Photodynamic therapy, PDT)是一種以光、光敏劑和氧的相互作用為基礎(chǔ)的癌癥治療方法[1]。其中光敏劑是光動力療法的關(guān)鍵所在[2]，光敏劑對腫瘤組織具有選擇性，可在光照下產(chǎn)生單線態(tài)氧殺傷降解腫瘤組織。卟啉類化合物作為應(yīng)用于PDT治療與診斷的光敏劑，其結(jié)構(gòu)具有剛性，可較好地控制其周邊官能團(tuán)的方向和位置[3, 4]；冠醚是一種人工合成的受體，分子具有疏水性的外部骨架，又有親水性內(nèi)腔[5]。因此，作者設(shè)計(jì)在中位四苯基卟啉的β-位引入冠醚基團(tuán)，通過對β-(2,3-二羥基萘基)-5,10,15,20-四苯基卟啉進(jìn)行修飾合成Annulated型[6]冠醚卟啉，并研究了其光敏活性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

所用試劑和溶劑均用標(biāo)準(zhǔn)方法純化。柱層析硅膠(200～300目，100～120 ℃活化 1 h)，青島海洋化工廠；三羥甲基氨基甲烷-乙酸/鹽酸 (TAE/TBE) 緩沖溶液(pH=7.4，0.05 mol·L-1Tris-HCl，0.1 mol·L-1NaCl)；溴酚藍(lán)、溴化乙錠(EB)、瓊脂糖、pBR322質(zhì)粒DNA，日本Toyobo公司；小牛胸腺DNA(ct-DNA)、1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)，華美生物工程公司。

Trace GC-MS質(zhì)譜儀，美國Thermo Finnigan公司；204B型元素分析儀，美國Perkin-Elmer公司；Mercury 300型超導(dǎo)核磁共振儀，美國Varian公司；FTIR-8100型紅外光譜儀、UV-2450型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；DYY-8B型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀，南京普陽科學(xué)儀器研究所；Lourmat Bio Print-1000型凝膠成像分析系統(tǒng)，法國Vilber公司；高壓汞燈(波長范圍350～800 nm，50 W)，西安教學(xué)儀器廠。

1.2 方法

β-(2,3-二羥基萘基)-5,10,15,20-四苯基卟啉的合成參照文獻(xiàn)[7]。β-(2,3-二羥基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉合成路線見圖1。

圖1 β-(2,3-二羥基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉的合成路線

1.2.1 化合物Ⅲ的合成

稱取200 mg(0.24 mmol)化合物Ⅰ投入100 mL的三口燒瓶中，加入50 mL無水DMF溶解，氬氣保護(hù)并電磁攪拌，升溫至100 ℃。取200 mg剛焙燒的碳酸鈉和3 mL(0.24 mmol)雙(2-溴乙基)醚加入反應(yīng)瓶中，TCL監(jiān)測反應(yīng)(展開劑:氯仿∶環(huán)己烷=1∶1)，反應(yīng)約36 h。反應(yīng)停止后加入50 mL水，抽濾干燥得到固體，用硅膠過柱(淋洗劑:氯仿∶環(huán)己烷=1∶3)，收集深紅色主帶第3帶，得紫紅色固體化合物Ⅲ 107 mg，產(chǎn)率48%。UV-Vis(CHCl3),λmax,nm:423,540;IR(KBr),ν,cm-1:3053(ArC-H),2919,2849(C-H),2757,1441(Ar-H),1440,1343(O-H),1176,1072 (C-O),1004 (Cu-N);MS(GC-MS),m/z:904[M+,100]。

1.2.2 化合物Ⅳ的合成

稱取200 mg(0.24 mmol)化合物Ⅱ投入100 mL的三口燒瓶中，其它操作同1.2.1，得紫紅色晶體化合物Ⅳ95 mg，產(chǎn)率44%。UV-Vis(CHCl3),λmax，nm:420,549;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:8.86～8.52(m,7H,Hβ-pyrrolic),8.23～8.03(m,8H,5,10,15,20-HoPh),7.93～7.25(m,12H,5,10,15,20,HmPh,pPh),7.23～6.46(m,5H,Ar-H),4.71～3.53(m,8H,C-H),-2.59(s,2H,N-H); IR(KBr),ν，cm-1:3412,1278(N-H),2959(ArC-H),2927,2872(C-H),1121,1072(C-O),800,746(Ar-H); MS(GC-MS),m/z:843[M+,100]。

1.3 β-萘并冠醚卟啉產(chǎn)生單線態(tài)氧能力的測定

將待測卟啉溶液和DPBF混溶于Tris-HCl緩沖溶液中，使卟啉濃度為1 μmol·L-1、DPBF濃度為100 μmol·L-1。取3 mL混合液于比色皿中，用高壓汞燈照射(距離為20 cm)，用紫外分光光度計(jì)測量溶液在415 nm處吸光度值，以光照時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作圖，比較其產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力。

1.4 β-萘并冠醚卟啉切割pBR322質(zhì)粒DNA的測定

配制1%的瓊脂糖(含0.1%的EB)，制成凝膠。將0.5 μL pBR322質(zhì)粒DNA分別和0.5 μL不同的冠醚卟啉光敏劑混合，在37 ℃下用高壓汞燈光照2 h (距離為20 cm)，同時(shí)做未光照的對照實(shí)驗(yàn)。停止光照后加0.5 μL溴酚藍(lán)，在90 V下電泳1.5 h，用凝膠成像分析系統(tǒng)照相。

1.5 β-萘并冠醚卟啉與ct-DNA滴定的紫外可見吸收光譜測定

取3 mLTris-HCl緩沖溶液分別加入到參比池和樣品池中，樣品池中加入3 μmol冠醚卟啉溶液(卟啉濃度為1μmol·L-1) 。用紫外分光光度計(jì)記錄隨著ct-DNA濃度的增加，溶液在300～600 nm光譜范圍內(nèi)的特征吸收峰變化情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成與表征

合成冠醚卟啉的過程中發(fā)生了分子內(nèi)的SN2反應(yīng)，因此，溶液中加入碳酸鈉作為去酸劑使整個(gè)反應(yīng)體系維持堿性，β-二酚卟啉即可形成芳氧負(fù)離子，有利于反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)前通入高純氬氣除去體系中的氧氣以避免反應(yīng)原料的氧化。由于目標(biāo)產(chǎn)物C-O鍵與硅膠的吸附較強(qiáng)且有拖帶現(xiàn)象，故選擇極性較小的展開劑進(jìn)行分離。當(dāng)原料為化合物Ⅰ時(shí)，第1帶為棕褐色，為少量脫去萘酚的5,10,15,20-四苯基硝基卟啉銅；第2帶為未反應(yīng)的β-(2,3-二羥基萘基)-5,10,15,20-四苯基卟啉銅；第3帶紅色主帶為目標(biāo)產(chǎn)物冠醚卟啉銅。當(dāng)?shù)?和第2帶分離出來后，改用氯仿將第3帶產(chǎn)物淋洗下來，溶液蒸干得到紫紅色固體即為目標(biāo)產(chǎn)物Ⅲ。

以CDCl3為溶劑的1HNMR圖譜中，δ8.86～8.52歸屬為吡咯環(huán)上的氫(7H),δ8.23～7.25歸屬為卟啉中位苯環(huán)上的氫(20H)，δ7.23～6.46歸屬為萘基上的氫(5H)，δ4.71～3.53歸屬為冠醚上的氫(8H)，N-H質(zhì)子化學(xué)位移出現(xiàn)在δ-2.59(2H)。紅外吸收光譜中3412 cm-1、1278 cm-1處較強(qiáng)的峰歸屬為N-H伸縮振動峰，2959 cm-1處歸屬為萘酚上的C-H伸縮振動峰，2927 cm-1、2872 cm-1處歸屬為C-H的伸縮振動峰，1121 cm-1、1072 cm-1歸屬為C-O的伸縮振動峰，800 cm-1、746 cm-1處較弱的峰歸屬為Ar-H的彎曲振動峰。

圖2 化合物Ⅲ的高分辨質(zhì)譜

在高分辨質(zhì)譜圖(圖2)中，β-(2,3-二羥基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉銅的分子離子峰出現(xiàn)在904，豐度為100%；卟啉在脫去銅分子后的分子離子峰出現(xiàn)在843，豐度為30%，與目標(biāo)產(chǎn)物的理論值相符合。 圖3為化合物Ⅲ的主要離子碎片峰的數(shù)據(jù)。

圖3 化合物Ⅲ的主要離子碎片峰

2.2 β-萘并冠醚卟啉產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力

卟啉化合物在光照條件下產(chǎn)生單線態(tài)氧產(chǎn)率的高低決定了其光敏能力的大小[8]；DPBF是一種單線態(tài)氧捕捉劑。用紫外分光光度計(jì)測定卟啉在415 nm處光照不同時(shí)間時(shí)吸光度的變化，可以判斷卟啉產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力?；衔铫蟆ⅱ糇饔孟翫PBF的分解率見圖4，曲線的斜率代表光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力。

圖4 化合物Ⅲ、Ⅳ作用下DPBF的分解率

從圖4可以看出，化合物Ⅲ、Ⅳ的曲線斜率分別為-0.0024、-0.0080。表明β-(2,3-二羥基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉化合物均具有產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力，其中化合物Ⅲ產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力相對較弱，這是由于銅是順磁性金屬離子，可明顯降低卟啉反應(yīng)中氧分子的單線態(tài)壽命，導(dǎo)致單線態(tài)氧產(chǎn)率降低。化合物Ⅳ比相應(yīng)化合物Ⅱ的斜率(文獻(xiàn)[7]值為-0.0078)稍高，表明冠醚卟啉具有明顯的產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力。

2.3 β-萘并冠醚卟啉切割pBR322質(zhì)粒DNA

圖5為600 μmol·L-1、400 μmol·L-1、200 μmol·L-1、100 μmol·L-1的化合物Ⅳ在光照和無光照的條件下切割超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

從圖5可以看出，化合物Ⅳ在光照下對DNA有一定的切割作用，說明冠醚卟啉在光照下產(chǎn)生的單線態(tài)氧能夠?qū)NA產(chǎn)生有效的切割作用，且隨著化合物Ⅳ濃度的增大，對DNA的切割作用逐漸增強(qiáng)，濃度為400 μmol·L-1(條帶 2)切割效果最好, 濃度繼續(xù)提高至600 μmol·L-1(條帶 1), 切割效果變化不大。

圖5化合物Ⅳ分別在不同濃度下對超螺旋pBR322DNA的切割

Fig.5CleavageofsupercoiledpBR322DNAbycompoundⅣatdifferentconcentrations

2.4 β-萘并冠醚卟啉與ct-DNA滴定的紫外可見吸收光譜

由于卟啉化合物的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其在紫外可見吸收光譜中具有明顯的卟啉特征吸收峰(Soret帶及Q帶)，因此用紫外可見吸收光譜來研究卟啉與DNA的相互作用。

ct-DNA滴定化合物Ⅳ的紫外可見吸收光譜見圖6。

1～8,cDNA(×10-5 mol·L-1):0,2,4,6,8,10,12,14

從圖6可以看出，隨著ct-DNA濃度的增大，化合物Ⅳ的Soret帶出現(xiàn)明顯的減色，減色率為49%，但紅移不明顯(△λ=1 nm)。說明化合物Ⅳ與ct-DNA作用后，卟啉的大環(huán)π*共軛體系與DNA堿基的大π共軛體系發(fā)生了相互作用，表明卟啉分子主要沿DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)表面的自堆積的外部鍵合作用[9～12]。

3 結(jié)論

以2,3-二羥基萘基四苯基卟啉及其Cu(Ⅱ)配合物為原料，合成了β-(2,3-二羥基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉光敏劑，并檢測了該冠醚卟啉的光敏活性及其與DNA的相互作用。結(jié)果表明，β-二羥基萘并冠醚卟啉具有明顯的產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力；與DNA的相互作用模式為外部自堆積；其對DNA具有較好的光敏切割效果。

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