柯 鋒

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

隨著人類基因組計劃的完成，相關(guān)基因與具體疾病之間的相互關(guān)系成為后基因組時代的研究熱點，如遺傳病基因治療、癌癥基因治療及以艾滋病為代表的重要感染性疾病的治療。因此，以DNA為藥物作用靶標(biāo)的研發(fā)也越來越受到世界各大制藥廠商和醫(yī)藥專家的極大關(guān)注。20世紀(jì)80年代末，美國Dervan研究組受到偏端霉素A結(jié)構(gòu)特點的啟發(fā)，將研究重點轉(zhuǎn)向以寡聚酰胺(Polyamide)為模板的DNA識別分子調(diào)控基因表達(dá)的研究。日本京都大學(xué)的Sugiyama研究組同F(xiàn)ukuda研究組合作，深入開展了對這類物質(zhì)的合成和生物活性測試方面的研究。

寡聚酰胺是繼核酸反義技術(shù)和RNA干擾技術(shù)之后，小溝結(jié)合物(Minor groove binder，MGB)研究的又一熱點，也是迄今為止最具潛力開發(fā)成以基因為靶標(biāo)的治療藥物的合成小分子化合物之一，因此其相關(guān)研究具有重要的現(xiàn)實意義。作者在此綜述了該類化合物的化學(xué)與生物學(xué)研究進(jìn)展。

1 由偏端霉素A到寡聚酰胺對DNA分子的識別作用

自然界里抗生素偏端霉素A是一類天然的DNA識別小分子物質(zhì)，具有抗病毒和抗腫瘤活性。偏端霉素A的分子結(jié)構(gòu)特點是由芳香環(huán)通過酰胺鍵連接而成的平面共軛體系，其核心結(jié)構(gòu)是寡聚含吡咯的酰胺，這種結(jié)構(gòu)對DNA的 AT富集區(qū)有高度選擇性識別作用，尤其與5′-AAATT-3′序列的結(jié)合性非常好。偏端霉素A能夠?qū)ΨQ地結(jié)合于DNA小溝的中間，分子中的每一個酰胺鍵均與相鄰堿基腺嘌呤的N(3)和另一條鏈上胞嘧啶的O(2)形成橋型的氫鍵，并通過范德華力和靜電相互作用與DNA結(jié)合，形成三明治狀結(jié)構(gòu)[1]。 受此啟發(fā)，美國Dervan研究組設(shè)計合成的吡咯-咪唑寡聚酰胺分子能在DNA雙螺旋小溝處按1∶1比例識別特定堿基(圖1)[2～5]；這類化合物一般由2～3種不同的芳香雜環(huán)通過酰胺鍵連接而成的平面共軛體系組成， 普遍用到的是N-甲基吡咯(Py) 和N-甲基咪唑(Im)，分別類似于天然抗生素 Netropsin 和Distamycin。為了讓寡聚酰胺分子能與G·C堿基對有效結(jié)合而引入了咪唑基團，合成的ImPyPyDp分子(Dp=N，N-二甲基丙胺)以2∶l的比例反向平行與DNA小溝處的5′-TGTCA-3′序列結(jié)合[6]。接著Dervan等[7]將γ-氨基丁酸(γ)引入寡聚酰胺分子中，設(shè)計并合成了一種新型的頭尾相連的發(fā)夾狀(Hairpin)寡聚酰胺，即通過γ-氨基丁酸將兩條反向平行寡聚酰胺鏈的C端與N端連結(jié)起來，在分子內(nèi)引導(dǎo)形成轉(zhuǎn)折。人工合成的寡聚酰胺分子中通常還含有β-氨基丙酸(β)和N，N-二甲基丙胺(Dp)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸(γ)和β-氨基丙酸(β)不僅充當(dāng)連接的角色，也是具有一定序列選擇性的重要構(gòu)件基團；Dp則能使寡聚酰胺分子在人體pH值條件下以陽離子的形式存在，增大分子的水溶性，同時對寡聚酰胺分子識別DNA時的分子取向以及對細(xì)胞膜的穿透也有重要意義[8～10]。

Py.N-methylpyrrole Im.N-methylimidazole γ-turn.γ-aminobutyric acid Hp.3-hydroxy-1-methylpyrrole β-tail.β-alanine dimethylamino propylamide

2 寡聚酰胺與DNA堿基的識別配對規(guī)則及結(jié)合模式

含吡咯-咪唑寡聚酰胺以其配對的芳香族氨基酸與相應(yīng)DNA的堿基通過最大可能地形成氫鍵識別DNA序列。大量實驗結(jié)果表明：寡聚酰胺分子主要通過反向配對的Py和Im實現(xiàn)對DNA特定序列的識別。據(jù)此，Dervan提出了寡聚酰胺識別DNA的配對規(guī)則：反向平行成對的Py/Im特異識別C·G堿基對，Im/Py特異識別G·C堿基對；反向平行成對的Hp/Py特異識別T·A堿基對，Py/Hp特異識別A·T堿基對，Py/Py特異識別T·A或A·T堿基對[11]。研究還發(fā)現(xiàn)，Im/β和β/Im能夠從A·T和T·A中識別G·C和C·G堿基對，而Py/β和β/Py能夠從G·C和C·G中識別A·T和T·A堿基對[12]。這類分子可在DNA的小溝處連續(xù)識別4～5個d(AoT)堿基對，由此1分子的寡聚酰胺與1條雙鏈DNA通過結(jié)構(gòu)匹配和氫鍵作用形成特異性識別作用(1∶1模型，圖2a)[4]。多維核磁數(shù)據(jù)也證明在一定濃度下寡聚酰胺以反向平行肩并肩的結(jié)合方式(即2分子結(jié)合到DNA雙螺旋小溝處且分別與2條鏈上DNA通過結(jié)構(gòu)匹配和氫鍵形成)識別DNA的堿基序列(2∶1模型，圖2b)，通過γ-氨基丁酸(γ) 連接2分子形成發(fā)夾狀寡聚酰胺(1∶1模型，圖2c)[2,13,14]。利用這個識別規(guī)律，科學(xué)家們可以針對某一特定序列設(shè)計出相應(yīng)的寡聚酰胺識別分子對其進(jìn)行特異性識別，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因而達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的。

圖2 吡咯-咪唑寡聚酰胺與DNA雙螺旋作用的1∶1模型(a)、 吡咯-咪唑寡聚酰胺與DNA雙螺旋作用的2∶1模型(b)、發(fā)夾狀寡聚酰胺與DNA雙螺旋作用的1∶1模型(c)

3 寡聚酰胺的透膜能力

根據(jù)特定DNA序列設(shè)計的寡聚酰胺要發(fā)揮對特定基因的調(diào)控作用，能否穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核是關(guān)鍵的一步。Janssen等[15]和Sun等[16]最先開展了這方面的研究，他們分別先用聚甲醛固定果蠅Kc細(xì)胞和人類結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1，再加入用熒光素標(biāo)記的寡聚酰胺進(jìn)行共培養(yǎng)，熒光素標(biāo)記定位顯示寡聚酰胺都能順利進(jìn)入這兩種細(xì)胞的細(xì)胞核。Belitsky等[17]、Best等[18]和Dudouet等[19]利用激光共聚焦顯微鏡觀察了多種活細(xì)胞中寡聚酰胺的透膜能力。結(jié)果表明寡聚酰胺能否進(jìn)入細(xì)胞核主要取決于細(xì)胞的類型，例如在SKBR-3(人類乳腺癌細(xì)胞)、NB4(人類白血病細(xì)胞)、293(成纖維細(xì)胞)、Sf9(昆蟲細(xì)胞)和Kc(果蠅細(xì)胞)中，寡聚酰胺都能進(jìn)入胞質(zhì)，但未能透過核膜進(jìn)入細(xì)胞核；而在T細(xì)胞系CEM、MT-2、PM1及髓系細(xì)胞KYO1中則可以順利進(jìn)入細(xì)胞核。此外，寡聚酰胺的結(jié)構(gòu)(如分子中是否含有β-氨基丙酸和咪唑基團及其位置和數(shù)量)明顯影響到寡聚酰胺進(jìn)入細(xì)胞核的能力[20]。

4 體外細(xì)胞水平寡聚酰胺調(diào)控基因表達(dá)

為考察寡聚酰胺類識別分子順利進(jìn)入細(xì)胞核后，是否與特定DNA序列特異性識別并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，研究者對體外細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行了研究。

Dickinson等[21]根據(jù)HIV-1病毒核酸序列增強子/啟動子中多種轉(zhuǎn)錄因子如TBP、ETs-1和LEF-1等的識別序列，合成了分別與HIV-1基因TATA盒、LEF-1元件和ETs-1元件側(cè)翼序列相匹配和錯配的寡聚酰胺分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)匹配的寡聚酰胺能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子與靶序列結(jié)合從而抑制RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄。而錯配的寡聚酰胺沒有這樣的效果。Lai等[22]合成了與轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)啟動子FSE2元件側(cè)翼堿基序列(-545～-539 bp)匹配及錯配的寡聚酰胺，將匹配的寡聚酰胺與人平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)體系共同孵育48 h，TGF-β1啟動子的活性顯著降低，TGF-β1的mRNA和蛋白轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到明顯抑制。研究表明，聯(lián)合應(yīng)用多個匹配的寡聚酰胺以阻斷病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制是治療疑難疾病的新策略。

5 體內(nèi)動物模型中寡聚酰胺調(diào)控基因表達(dá)

寡聚酰胺分子在動物體內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的機制，是通過特異性和某段基因序列相結(jié)合，從而對與該段基因序列結(jié)合的某些關(guān)鍵性的酶產(chǎn)生競爭性抑制作用來實現(xiàn)的(圖3)[13]。相關(guān)研究的最初實驗對象是以果蠅為主，其后研究寡聚酰胺對胚胎發(fā)育的影響、在小鼠模型上針對特定基因的轉(zhuǎn)錄抑制實驗都取得了不錯的結(jié)果。

圖3 含吡咯-咪唑寡聚酰胺分子抑制基因表達(dá)作用模式

Dickinson等[23]設(shè)計的一種寡聚酰胺-瘤可寧結(jié)合物可作用于組蛋白H4C基因編碼區(qū)，抑制多種腫瘤細(xì)胞系的增殖，且該結(jié)合物在荷瘤小鼠體內(nèi)同樣具有生物活性。Matsuda等[24]以Dahl-S小鼠為模型，設(shè)計了一種針對TGF-β1基因啟動子AP-1元件的寡聚酰胺，能明顯抑制小鼠腎小球系膜細(xì)胞中該基因啟動子的活性。熒光素標(biāo)記的寡聚酰胺靜脈注射小鼠后可分布到腎臟，顯著抑制腎臟皮質(zhì)中TGF-β1的mRNA和蛋白的表達(dá)，并且不依賴血壓變化就能減少尿蛋白。這種寡聚酰胺分子有可能治療TGF-β1高表達(dá)相關(guān)的疾病。最近，Washio等[25]、Matsuda等[26]建立了小鼠增生性疤痕的動物模型，設(shè)計了針對其TGF-β1啟動子區(qū)的配對的寡聚酰胺分子作為篩選藥物并以錯配的寡聚酰胺分子作為參照，分別從外觀和微觀切片的角度進(jìn)行觀察并在mRNA和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示配對的寡聚酰胺分子較好地抑制了TGF-β1的高表達(dá)，而錯配的寡聚酰胺的抑制效果不明顯，這些成果將這類化合物走向臨床靶向治療推進(jìn)了一大步。

6 展望

DNA是遺傳信息的載體，也是藥物作用的重要靶點。隨著人們對遺傳信息越來越深入的認(rèn)識，利用已知的遺傳信息開發(fā)出治療相關(guān)重大疾病的藥物是科學(xué)家一直努力的方向。寡聚酰胺是一種新型的調(diào)控基因表達(dá)的DNA識別分子，與反義寡聚核苷酸和肽核酸相比更穩(wěn)定、細(xì)胞通透性能更好，而且具有高度的序列選擇性與結(jié)合力，能有效地抑制或激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。此外，寡聚酰胺識別分子不僅可以應(yīng)用于抗腫瘤和抗病毒研究，還在醫(yī)學(xué)診斷、生物標(biāo)記、抗細(xì)菌、抗真菌等方面有著廣泛的應(yīng)用潛能，是一種很有前途的基因靶向篩選藥物。

[1] Pindur U,Jansen M,Lemster T.Advances in DNA-ligands with groove binding，intercalating and/or alkylating activity：Chemistry,DNA-binding and biology[J].Curr Med Chem,2005,12(24):2805-2847.

[2] 江世坤.手性修飾的寡聚酰胺的構(gòu)建及其對B-DNA堿基T的特異性識別[D].杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2011.

[3] Pelton J G,Wemmer D E. Structural characterization of a 2∶1 distamycin A.d (CGCAAATTTGGC) complex by two-dimensional NMR[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(15):5723-5727.

[4] Wade W S,Mrksich M,Dervan P B. Design of peptides that bind in the minor groove of DNA at 5′-(A,T)G(A,T)C(A,T)-3′ sequences by a dimeric side-by-side motif[J].J Am Chem Soc,1992,114(23):8783-8794.

[5] White S,Szewczyk J W,Turner J M,et al. Recognition of the four Watson-Crick base pairs in the DNA minor groove by synthetic ligands[J].Nature,1998,391(6666):468-471.

[6] Kelly J J,Baird E E，Dervan P B．Binding site limit of the 2∶1 pyrrole-imidazole polyamide-DNA motif[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(14):6981-6985．

[7] Dervan P B，Doss R M，Marques M A．Programmable DNA binding oligomers for control of transcription[J].Curt Med Chem Anticancer Agents,2005,5(4):373-387．

[8] Cho J Y,Parks M E,Dervan P B. Cyclic polyamides for recognition in the minor-groove of DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(22):10389-10392.

[9] Herman D M,Turner J M,Baird E E,et al. Cycle polyamide motif for recognition of the minor groove of DNA[J].J Am Chem Soc,1999,121(6):1121-1129.

[10] Turner J M,Swalley S E,Baird E E,et al. Aliphatic/aromatic amino acid pairings for polyamide recognition in the minor groove of DNA[J].J Am Chem Soc,1998,120(25):6219-6226.

[11] Wemmer D E，Dervan P B．Targeting the minor groove of DNA[J].Curr Opin Struct Biol，1997,7(3):355-361.

[12] Surveyor G A，Wilson A K，Brigstock D R. Localization of connective tissue growth factor during the period of embryo implantation in the mouse[J].Biol Reprod,1998,59(5):1207-1213.

[13] Dervan P B. Molecular recognition of DNA by small molecules[J].Bioorg Med Chem,2001,9(9):2215-2235.

[14] Dervan P B,Edelson B S. Recognition of the DNA minor groove by pyrrole-imidazole polyamides[J].Curr Opin Struct Biol,2003,13(3):284-299.

[15] Janssen S,Durussel T,Laemmli U K．Chromatin opening of DNA satellites by targeted sequence-specific drugs[J].Mol Cell,2000,6(5):999-1011.

[16] Sun X H，Baltimore D.An inhibitory domain of E12 transcription factor prevents DNA binding in E12 homodimers but not in E12 heterodimers[J].Cell,1991,64(2):459-470.

[17] Belitsky J M,Leslie S J,Arora P S,et al. Cellular uptake ofN-methyl pyrrole/N-methyl imidazole polyamide-dye conjugates[J].Bioorg Med Chem,2002,10(10):3313-3318.

[18] Best T P，Edelson B S，Nickols N G，et al．Nuclear localization of pyrrole-imidazole polyamide-fluorescein conjugates in cell culture[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(21):12063-12068.

[19] Dudouet B,Burnett R,Dickinson L A,et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides[J].Chem Biol,2003,10(9):859-867.

[20] Edelson B S,Best T P,Olenyuk B,et al. Influence of structural variation on nuclear localization of DNA-binding polyamide-fluorophore conjugates[J].Nucleic Acids Res,2004,32(9):2802-2818.

[21] Dickinson L A,Gulizia R J,Trauger J W,et al. Inhibition of RNA polymerase Ⅱ transcription in human cells by synthetic DNA-binding ligands[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(22):12890-12895.

[22] Lai Y M,Fukuda N,Ueno T,et al. Synthetic pyrrole-imidazole polyamide inhibits expression of the human transforming growth factor-beta1 gene[J].J Pharmacol Exp Ther,2005,315(2):571-575.

[23] Dickinson L A,Burnett R,Melander C,et al. Arresting cancer proliferation by small-molecule gene regulation[J].Chem Biol,2004,11(11):1583-1594.

[24] Matsuda H,Fukuda N,Ueno T,et al. Development of gene silencing pyrrole-imidazole polyamide targeting the TGF-beta1 promoter for treatment of progressive renal diseases[J].J Am Soc Nephrol,2006,17(2):422-432.

[25] Washio H,Fukuda N,Matsuda H,et al. Transcriptional inhibition of hypertrophic scars by a gene silencer,pyrrole-imidazole polyamide,targeting the TGF-β1 promoter[J].J Invest Dermatol,2011,131(10):1987-1995.

[26] Matsuda H,Fukuda N,Ueno T,et al. Transcriptional inhibition of progressive renal disease by gene silencing pyrrole-imidazole polyamide targeting of the transforming growth factor-β1 promoter[J].Kidney International,2011,79(1):46-56.